發(fā)酵過程控制發(fā)酵染菌及其防治

1、7發(fā)酵過程控制,,1 發(fā)酵工業(yè)的無菌處理滅菌消毒除菌防腐,發(fā)酵染菌及其防治,什么是染菌？發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長繁殖,一、染菌的影響,發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴(yán)重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費，在經(jīng)濟上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量,2 發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略,發(fā)酵染菌及其防治,

2、（一）染菌對發(fā)酵的影響,生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物。不同污染時間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果,發(fā)酵染菌及其防治,1、發(fā)酵染菌對不同品種的影響,放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌

3、，都能使青霉素迅速破壞。,不同菌,不同產(chǎn)品,鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量?；尹S霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。,發(fā)酵染菌及其防治,疫苗生產(chǎn)危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部

4、廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。,不同產(chǎn)品,發(fā)酵染菌及其防治,2、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響,（1）污染噬菌體 噬菌體的感染力很強，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。,,發(fā)酵染菌及其防治,（2）污染其它雜菌 有些雜菌會使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，

5、致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會反復(fù)染菌。,發(fā)酵染菌及其防治,3、不同時間染菌對發(fā)酵的影響,污染時間是指用無菌檢測方法確準(zhǔn)的污染時間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時間。雜菌進入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才能顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時間就長。,,發(fā)酵染菌及其防治,（1）種子培養(yǎng)期染菌,由于接種量較小，生

6、產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，而且培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有很少抗生素（產(chǎn)物）。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。,,發(fā)酵染菌及其防治,（2）發(fā)酵前期染菌,發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌措施 可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補料量，用酸堿調(diào)p

7、H值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。,發(fā)酵染菌及其防治,（3）發(fā)酵中期染菌,發(fā)酵中期染菌會嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施 降溫培養(yǎng)，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者

8、抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。,發(fā)酵染菌及其防治,（4）發(fā)酵后期染菌,發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。,發(fā)酵染菌及其防治,（二）發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響,1、發(fā)酵染菌對過濾的影響,染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導(dǎo)致過濾困難。即使采取加

9、熱、冷卻、添加助濾劑等措施，使部分蛋白質(zhì)凝聚，但效果并不理想。,污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時，影響較小，而污染細菌時很難過濾。由于過濾困難，過濾時間拉長，影響發(fā)酵液儲罐和過濾設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而大幅度降低過濾收率，直接影響提煉總收率。,發(fā)酵染菌及其防治,2、發(fā)酵染菌對提煉的影響,染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。采用有機溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化

10、，很難使水相和溶劑相分離，影響進一步提純。采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進入洗脫液，影響進一步提純。,發(fā)酵染菌及其防治,二、染菌的原因,（一）發(fā)酵染菌率計算基準(zhǔn)總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。染菌批次數(shù)應(yīng)包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染

11、菌的批次數(shù)在內(nèi)。這是習(xí)慣的計算方法，也是我國的統(tǒng)一計算方法?？?cè)揪?=,,發(fā)酵染菌及其防治,（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但總結(jié)幾十年的經(jīng)驗，對絕大部分罐批染菌的原因是比較清楚的，但在實際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率仍比較高，可以說產(chǎn)生這種現(xiàn)象大多數(shù)是由于工作中“明知故犯”“不負(fù)責(zé)任”和“僥幸心理”所造成的。例如，滅菌的蒸汽壓不足不能滅菌；設(shè)備有滲漏不能進罐等等都是眾所周知的，但因為有僥幸心理還是照樣滅菌，進罐，結(jié)果以污染雜菌而

12、告終?，F(xiàn)將我們收集到的國內(nèi)外幾家抗生素工廠發(fā)酵染菌原因列于下：,發(fā)酵染菌及其防治,日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透

13、 0.79總空氣系統(tǒng)有菌 19.96泡沫冒頂 0.48夾套穿孔 12.36盤管穿孔 5.89

14、接種管穿孔 0.39閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏 1.54其它設(shè)備滲漏

15、 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94,發(fā)酵染菌及其防治,上海第三制藥廠染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌

16、 14.15盤管穿孔 14.20閥門滲漏 23.30空氣系統(tǒng)有菌 10.0管理不善 25.80其它 7.49原因不明

17、 5.78,發(fā)酵染菌及其防治,管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08％經(jīng)分析有下表所列原因： 項目 百分率%進罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查 25.8接種違反操作規(guī)程 25.8檢修質(zhì)量缺乏驗收制度 19.35操作

18、不熟練 19.35配料違反工藝規(guī)程 6.45調(diào)度不當(dāng) 3.25,發(fā)酵染菌及其防治,第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%外界帶入雜

19、菌（取樣、補料） 8.20設(shè)備穿孔 7.60空氣系統(tǒng)有菌 26.00停電罐壓跌零 1.60接種

20、11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足 0.60管理問題 7.80 操作違反規(guī)程 1.60種子帶菌 0.60原因不明

21、 35.00,發(fā)酵染菌及其防治,造成染菌的主要原因總結(jié),1、設(shè)備滲漏,設(shè)備滲漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。從日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所對染菌原因分析發(fā)現(xiàn)，這類染菌占33.85％，上海三廠的分析這類染菌為37.5％。所以說加強設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查，對制服染菌是極其主要的，也是重要的。,發(fā)酵染菌及其防治,2、空氣帶菌,從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥

22、廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96％和 26%。國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因為空氣除菌系統(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會導(dǎo)致空氣除菌失敗。,,,發(fā)酵染菌及其防治,3、種子帶菌,種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。加強種子管理，嚴(yán)格無菌操作，種子本身帶菌是可以克服的。種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵一樣有許多因素造成。,發(fā)酵染菌及其防治,4、滅菌不徹底,滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系

23、蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時間——產(chǎn)生過多泡沫蒸汽總壓是否達到要求標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。如上海第四制藥廠在卡那霉素生產(chǎn)中，于炎熱的夏季將連續(xù)滅菌預(yù)熱至800C的培養(yǎng)基采樣培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)無法計數(shù)的大量的芽孢桿菌；而在冬季取樣的培養(yǎng)中，則僅發(fā)現(xiàn)2～3個芽孢桿菌。故染菌率因季節(jié)不同而發(fā)生明顯變化。,發(fā)酵染菌及其防治,原材料儲存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機原料——雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量

24、——有無滅菌的死角對減少或避免染菌仍然是十分必要的。,發(fā)酵染菌及其防治,5、技術(shù)管理不善,技術(shù)管理就是要對發(fā)酵每個環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制，發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理,發(fā)酵染菌及其防治,三、無菌狀況的檢測,1、環(huán)境無菌的檢查塵埃粒子檢測無菌平板檢測,發(fā)酵染菌及其防治,2、種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測,酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測平板劃線顯微鏡觀察,發(fā)酵染菌及其防治,四、染菌情況分析,染菌的原因有多種，對于實際情況如何分析呢

25、？,1、單罐染菌不是系統(tǒng)問題，而是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效,2、多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補料的分配站有滲漏或滅菌不徹底,發(fā)酵染菌及其防治,3、前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底,4、中后期染菌補料的料液滅菌不徹底或補料管道、閥門滲漏，一般不會是種子問題,5、污染雜菌種類,發(fā)酵染菌及其防治,五、染菌的防止,1、防止種子帶菌,

26、制備種子時對沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。沙土制備時要多次間歇滅菌注意接種時的無菌操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。,發(fā)酵染菌及其防治,無菌室要求,在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關(guān)燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風(fēng)，接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風(fēng)機，進風(fēng)

27、口有一粗過濾器，出風(fēng)口有高效過濾器，保證無菌風(fēng)從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。,發(fā)酵染菌及其防治,2、防止設(shè)備滲漏及“死角”,發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，物料與設(shè)備摩擦造成機械磨損以及加工制作不良等原因會導(dǎo)致設(shè)備及附件滲漏。設(shè)備上一旦滲漏，就會造成染菌，例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會通過漏孔而進入發(fā)酵罐中招致染菌。閥門滲漏也會

28、使帶菌的空氣或水進入發(fā)酵罐而造成染菌。設(shè)備上的漏隙如果肉眼能看見，容易發(fā)現(xiàn)，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不見，必須通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn) 。,發(fā)酵染菌及其防治,試漏方法可采用水壓試漏法。即被測設(shè)備的出口處裝上壓力表，將水壓入設(shè)備，待設(shè)備中壓力上升到要求壓力，關(guān)閉進出水，看壓力有否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，可以用稀堿溶液壓入設(shè)備，然后用蘸有酚酞的紗布揩，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。 閥門滲

29、漏可以用集氣桶來試漏。方法是先在集氣桶中裝滿水，然后關(guān)閉所有閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到要求壓力，一般一公斤以上。由于集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，即這根管子的閥門漏氣。,發(fā)酵染菌及其防治,,“死角”是指由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)或人為因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能倒到預(yù)定的滅菌部位或該部位的冷空氣不易在加熱過程中排凈，從而不能達到徹底滅菌要求的部位。 發(fā)酵罐的死角 管道安裝不

30、當(dāng)或配置不合理形成的死角,發(fā)酵染菌及其防治,3、防止培養(yǎng)基滅菌不徹底,培養(yǎng)基滅菌前含有大量雜菌，滅菌時如果蒸汽壓力不足，就達不到要求的溫度；滅菌時產(chǎn)生大量泡沫或發(fā)酵罐中有污垢堆積，就會窩藏大量雜菌，造成滅菌不徹底。培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。,防止方法： 緩慢開啟蒸汽閥門，或加

31、入少量消泡劑。滅菌時還會因設(shè)備安裝或污垢堆積造成一些“死角”。,發(fā)酵染菌及其防治,4、防止空氣引起的染菌,空氣過濾除菌設(shè)備流程,空壓機,儲罐,二級冷卻,加熱器,空氣過濾,粗過濾,發(fā)酵染菌及其防治,空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器長期使用后，棉花和活性炭的體積被壓縮而松動，如果上下端棉花鋪得厚薄不均，厚的一邊阻力大空氣不暢通，薄的一邊空氣容易通過，久而久之，薄的一邊長期受空氣頂吹而使棉花活性

32、炭改變位置，造成過濾器失效。過濾器用蒸汽滅菌時，若被蒸汽冷凝水潤濕就會降低或喪失過濾效能，滅菌完畢應(yīng)立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。,發(fā)酵染菌及其防治,超細纖維紙作過濾介質(zhì)，滅菌時必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效。在生產(chǎn)實踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過濾器，導(dǎo)致過濾介質(zhì)失效。,發(fā)酵染菌及其防治,,5、防止操作不當(dāng)染菌,6、防止噬菌體污染,發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般

33、發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止，而且受噬菌體感染后，往往會反復(fù)連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進行，甚至使種子全部喪失。,發(fā)酵染菌及其防治,染噬菌體表現(xiàn)為：1、鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴(yán)重時完全看不到菌體，且是在短時間內(nèi)菌體自溶。2、發(fā)酵pH值逐漸上升，4~8小時之內(nèi)可達8.0以上，不再下降。3、發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味，粘度大，泡沫多?、生產(chǎn)量甚少或增長緩慢或停止有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗,發(fā)酵染菌及其防治,

34、（一）產(chǎn)生噬菌體的原因,通常在工廠投產(chǎn)初期并不感到噬菌體的危害，經(jīng)過1~2年以后，主要是由于生產(chǎn)和試驗過程中不斷不加注意地把許多活菌體排放到環(huán)境中去，自然界中的噬菌體就在活菌體中大量生長，造成了自然界中噬菌體增殖的好機會。這些噬菌體隨著風(fēng)沙塵土和空氣流動傳播，以及人們的走動、車輛的往來也攜帶著噬菌體到處傳播，使噬菌體有可能潛入生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，尤其是通過空氣系統(tǒng)進入種子室、種子罐、發(fā)酵罐,發(fā)酵染菌及其防治,（二）染噬菌體的檢測在培養(yǎng)皿上

35、倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基（加瓊脂）作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再加入懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。也可以在上層培養(yǎng)基中不加懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，而將發(fā)酵液直接點種在上層培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)過夜，觀察有無透明圈出現(xiàn)。,發(fā)酵染菌及其防治,（三）噬菌體的防治,1、必須建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度，定期檢查、定期清掃，車間四周有嚴(yán)重污染噬菌體的地方應(yīng)及時撒石灰或漂白粉。

36、2、車間地面和通往車間的道路盡量采取水泥地面 3、種子和發(fā)酵工段的操作人員要嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，認(rèn)真地進行種子保管，不使用本身帶有噬菌體的菌種。感染噬菌體的培養(yǎng)物不得帶入菌種室、搖瓶間,發(fā)酵染菌及其防治,4、認(rèn)真進行發(fā)酵罐、補料系統(tǒng)的滅菌。嚴(yán)格控制逃液和取樣分析和洗罐所廢棄的菌體。對倒罐所排放的廢液應(yīng)滅菌后才可排放。 5、選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種。 6、發(fā)現(xiàn)噬菌體停攪拌、小通風(fēng)，將發(fā)酵液加熱到70~8

37、00C殺死噬菌體，才可排放。發(fā)酵罐周圍的管道也必須徹底滅菌。,發(fā)酵染菌及其防治,六、發(fā)酵染菌后的措施,染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學(xué)滅菌劑攪拌半小時，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會造成空氣的污染而導(dǎo)致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，對癥下藥，該罐也要徹底清洗，進行空罐消毒，才可進罐。染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛