發(fā)酵過程控制發(fā)酵染菌及其防治

1、7發(fā)酵過程控制,,1 發(fā)酵工業(yè)的無菌處理滅菌消毒除菌防腐,發(fā)酵染菌及其防治,什么是染菌？發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長繁殖,一、染菌的影響,發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴重的影響生產(chǎn)，是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。造成大量原材料的浪費，在經(jīng)濟上造成巨大損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別在找不到染菌原因往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性。影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量,2 發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略,發(fā)酵染菌及其防治,

2、（一）染菌對發(fā)酵的影響,生產(chǎn)不同的品種，可污染不同種類和性質(zhì)的微生物。不同污染時間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產(chǎn)生不同后果,發(fā)酵染菌及其防治,1、發(fā)酵染菌對不同品種的影響,放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導而產(chǎn)生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌

3、，都能使青霉素迅速破壞。,不同菌,不同產(chǎn)品,鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量?；尹S霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。,發(fā)酵染菌及其防治,疫苗生產(chǎn)危害很大。現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應全部

4、廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。,不同產(chǎn)品,發(fā)酵染菌及其防治,2、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響,（1）污染噬菌體 噬菌體的感染力很強，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。,,發(fā)酵染菌及其防治,（2）污染其它雜菌 有些雜菌會使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，

5、致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會反復染菌。,發(fā)酵染菌及其防治,3、不同時間染菌對發(fā)酵的影響,污染時間是指用無菌檢測方法確準的污染時間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時間。雜菌進入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才能顯現(xiàn)出來，顯現(xiàn)的時間又與污染菌量有關(guān)。污染的菌量多，顯現(xiàn)染菌所需的時間就短，污染菌量少，顯現(xiàn)染菌的時間就長。,,發(fā)酵染菌及其防治,（1）種子培養(yǎng)期染菌,由于接種量較小，生

6、產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，而且培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產(chǎn)物）或只有很少抗生素（產(chǎn)物）。因而它防御雜菌能力低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應將培養(yǎng)液全部廢棄。,,發(fā)酵染菌及其防治,（2）發(fā)酵前期染菌,發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生。染菌措施 可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補料量，用酸堿調(diào)p

7、H值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。,發(fā)酵染菌及其防治,（3）發(fā)酵中期染菌,發(fā)酵中期染菌會嚴重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至會使已產(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施 降溫培養(yǎng)，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者

8、抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。,發(fā)酵染菌及其防治,（4）發(fā)酵后期染菌,發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴重，又破壞性較大，可以提前放罐。,發(fā)酵染菌及其防治,（二）發(fā)酵染菌對提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響,1、發(fā)酵染菌對過濾的影響,染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導致過濾困難。即使采取加

9、熱、冷卻、添加助濾劑等措施，使部分蛋白質(zhì)凝聚，但效果并不理想。,污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時，影響較小，而污染細菌時很難過濾。由于過濾困難，過濾時間拉長，影響發(fā)酵液儲罐和過濾設備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而大幅度降低過濾收率，直接影響提煉總收率。,發(fā)酵染菌及其防治,2、發(fā)酵染菌對提煉的影響,染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。采用有機溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化

10、，很難使水相和溶劑相分離，影響進一步提純。采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進入洗脫液，影響進一步提純。,發(fā)酵染菌及其防治,二、染菌的原因,（一）發(fā)酵染菌率計算基準總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。染菌批次數(shù)應包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染

11、菌的批次數(shù)在內(nèi)。這是習慣的計算方法，也是我國的統(tǒng)一計算方法?？?cè)揪?=,,發(fā)酵染菌及其防治,（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但總結(jié)幾十年的經(jīng)驗，對絕大部分罐批染菌的原因是比較清楚的，但在實際生產(chǎn)中發(fā)酵染菌率仍比較高，可以說產(chǎn)生這種現(xiàn)象大多數(shù)是由于工作中“明知故犯”“不負責任”和“僥幸心理”所造成的。例如，滅菌的蒸汽壓不足不能滅菌；設備有滲漏不能進罐等等都是眾所周知的，但因為有僥幸心理還是照樣滅菌，進罐，結(jié)果以污染雜菌而

12、告終?，F(xiàn)將我們收集到的國內(nèi)外幾家抗生素工廠發(fā)酵染菌原因列于下：,發(fā)酵染菌及其防治,日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透

13、 0.79總空氣系統(tǒng)有菌 19.96泡沫冒頂 0.48夾套穿孔 12.36盤管穿孔 5.89

14、接種管穿孔 0.39閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏 1.54其它設備滲漏

15、 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94,發(fā)酵染菌及其防治,上海第三制藥廠染菌原因分析 項目 百分率%種子帶菌

16、 14.15盤管穿孔 14.20閥門滲漏 23.30空氣系統(tǒng)有菌 10.0管理不善 25.80其它 7.49原因不明

17、 5.78,發(fā)酵染菌及其防治,管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08％經(jīng)分析有下表所列原因： 項目 百分率%進罐前未做設備嚴密度檢查 25.8接種違反操作規(guī)程 25.8檢修質(zhì)量缺乏驗收制度 19.35操作

18、不熟練 19.35配料違反工藝規(guī)程 6.45調(diào)度不當 3.25,發(fā)酵染菌及其防治,第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析 項目 百分率%外界帶入雜

19、菌（取樣、補料） 8.20設備穿孔 7.60空氣系統(tǒng)有菌 26.00停電罐壓跌零 1.60接種

20、11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足 0.60管理問題 7.80 操作違反規(guī)程 1.60種子帶菌 0.60原因不明

21、 35.00,發(fā)酵染菌及其防治,造成染菌的主要原因總結(jié),1、設備滲漏,設備滲漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設備漏等。從日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所對染菌原因分析發(fā)現(xiàn)，這類染菌占33.85％，上海三廠的分析這類染菌為37.5％。所以說加強設備本身及附屬零部件的嚴密度檢查，對制服染菌是極其主要的，也是重要的。,發(fā)酵染菌及其防治,2、空氣帶菌,從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥

22、廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96％和 26%。國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因為空氣除菌系統(tǒng)較為復雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會導致空氣除菌失敗。,,,發(fā)酵染菌及其防治,3、種子帶菌,種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。加強種子管理，嚴格無菌操作，種子本身帶菌是可以克服的。種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵一樣有許多因素造成。,發(fā)酵染菌及其防治,4、滅菌不徹底,滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系

23、蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時間——產(chǎn)生過多泡沫蒸汽總壓是否達到要求標準環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。如上海第四制藥廠在卡那霉素生產(chǎn)中，于炎熱的夏季將連續(xù)滅菌預熱至800C的培養(yǎng)基采樣培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)無法計數(shù)的大量的芽孢桿菌；而在冬季取樣的培養(yǎng)中，則僅發(fā)現(xiàn)2～3個芽孢桿菌。故染菌率因季節(jié)不同而發(fā)生明顯變化。,發(fā)酵染菌及其防治,原材料儲存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機原料——雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設備的清洗質(zhì)量

24、——有無滅菌的死角對減少或避免染菌仍然是十分必要的。,發(fā)酵染菌及其防治,5、技術(shù)管理不善,技術(shù)管理就是要對發(fā)酵每個環(huán)節(jié)嚴格控制，發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理,發(fā)酵染菌及其防治,三、無菌狀況的檢測,1、環(huán)境無菌的檢查塵埃粒子檢測無菌平板檢測,發(fā)酵染菌及其防治,2、種子及發(fā)酵液無菌狀況檢測,酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測平板劃線顯微鏡觀察,發(fā)酵染菌及其防治,四、染菌情況分析,染菌的原因有多種，對于實際情況如何分析呢

25、？,1、單罐染菌不是系統(tǒng)問題，而是該罐本身的問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效,2、多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補料的分配站有滲漏或滅菌不徹底,發(fā)酵染菌及其防治,3、前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底,4、中后期染菌補料的料液滅菌不徹底或補料管道、閥門滲漏，一般不會是種子問題,5、污染雜菌種類,發(fā)酵染菌及其防治,五、染菌的防止,1、防止種子帶菌,

26、制備種子時對沙土管及搖瓶嚴格加以控制。沙土制備時要多次間歇滅菌注意接種時的無菌操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學藥品滅菌。,發(fā)酵染菌及其防治,無菌室要求,在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關(guān)燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風，接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風機，進風

27、口有一粗過濾器，出風口有高效過濾器，保證無菌風從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。,發(fā)酵染菌及其防治,2、防止設備滲漏及“死角”,發(fā)酵設備及附件由于化學腐蝕、電化學腐蝕，物料與設備摩擦造成機械磨損以及加工制作不良等原因會導致設備及附件滲漏。設備上一旦滲漏，就會造成染菌，例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會通過漏孔而進入發(fā)酵罐中招致染菌。閥門滲漏也會

28、使帶菌的空氣或水進入發(fā)酵罐而造成染菌。設備上的漏隙如果肉眼能看見，容易發(fā)現(xiàn)，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不見，必須通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn) 。,發(fā)酵染菌及其防治,試漏方法可采用水壓試漏法。即被測設備的出口處裝上壓力表，將水壓入設備，待設備中壓力上升到要求壓力，關(guān)閉進出水，看壓力有否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，可以用稀堿溶液壓入設備，然后用蘸有酚酞的紗布揩，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。 閥門滲

29、漏可以用集氣桶來試漏。方法是先在集氣桶中裝滿水，然后關(guān)閉所有閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到要求壓力，一般一公斤以上。由于集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，即這根管子的閥門漏氣。,發(fā)酵染菌及其防治,,“死角”是指由于操作、設備結(jié)構(gòu)或人為因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能倒到預定的滅菌部位或該部位的冷空氣不易在加熱過程中排凈，從而不能達到徹底滅菌要求的部位。 發(fā)酵罐的死角 管道安裝不

30、當或配置不合理形成的死角,發(fā)酵染菌及其防治,3、防止培養(yǎng)基滅菌不徹底,培養(yǎng)基滅菌前含有大量雜菌，滅菌時如果蒸汽壓力不足，就達不到要求的溫度；滅菌時產(chǎn)生大量泡沫或發(fā)酵罐中有污垢堆積，就會窩藏大量雜菌，造成滅菌不徹底。培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。,防止方法： 緩慢開啟蒸汽閥門，或加

31、入少量消泡劑。滅菌時還會因設備安裝或污垢堆積造成一些“死角”。,發(fā)酵染菌及其防治,4、防止空氣引起的染菌,空氣過濾除菌設備流程,空壓機,儲罐,二級冷卻,加熱器,空氣過濾,粗過濾,發(fā)酵染菌及其防治,空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器長期使用后，棉花和活性炭的體積被壓縮而松動，如果上下端棉花鋪得厚薄不均，厚的一邊阻力大空氣不暢通，薄的一邊空氣容易通過，久而久之，薄的一邊長期受空氣頂吹而使棉花活性

32、炭改變位置，造成過濾器失效。過濾器用蒸汽滅菌時，若被蒸汽冷凝水潤濕就會降低或喪失過濾效能，滅菌完畢應立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。,發(fā)酵染菌及其防治,超細纖維紙作過濾介質(zhì)，滅菌時必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效。在生產(chǎn)實踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過濾器，導致過濾介質(zhì)失效。,發(fā)酵染菌及其防治,,5、防止操作不當染菌,6、防止噬菌體污染,發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般

33、發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止，而且受噬菌體感染后，往往會反復連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進行，甚至使種子全部喪失。,發(fā)酵染菌及其防治,染噬菌體表現(xiàn)為：1、鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴重時完全看不到菌體，且是在短時間內(nèi)菌體自溶。2、發(fā)酵pH值逐漸上升，4~8小時之內(nèi)可達8.0以上，不再下降。3、發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味，粘度大，泡沫多?、生產(chǎn)量甚少或增長緩慢或停止有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗,發(fā)酵染菌及其防治,

34、（一）產(chǎn)生噬菌體的原因,通常在工廠投產(chǎn)初期并不感到噬菌體的危害，經(jīng)過1~2年以后，主要是由于生產(chǎn)和試驗過程中不斷不加注意地把許多活菌體排放到環(huán)境中去，自然界中的噬菌體就在活菌體中大量生長，造成了自然界中噬菌體增殖的好機會。這些噬菌體隨著風沙塵土和空氣流動傳播，以及人們的走動、車輛的往來也攜帶著噬菌體到處傳播，使噬菌體有可能潛入生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，尤其是通過空氣系統(tǒng)進入種子室、種子罐、發(fā)酵罐,發(fā)酵染菌及其防治,（二）染噬菌體的檢測在培養(yǎng)皿上

35、倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基（加瓊脂）作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再加入懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。也可以在上層培養(yǎng)基中不加懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，而將發(fā)酵液直接點種在上層培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)過夜，觀察有無透明圈出現(xiàn)。,發(fā)酵染菌及其防治,（三）噬菌體的防治,1、必須建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度，定期檢查、定期清掃，車間四周有嚴重污染噬菌體的地方應及時撒石灰或漂白粉。

36、2、車間地面和通往車間的道路盡量采取水泥地面 3、種子和發(fā)酵工段的操作人員要嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，認真地進行種子保管，不使用本身帶有噬菌體的菌種。感染噬菌體的培養(yǎng)物不得帶入菌種室、搖瓶間,發(fā)酵染菌及其防治,4、認真進行發(fā)酵罐、補料系統(tǒng)的滅菌。嚴格控制逃液和取樣分析和洗罐所廢棄的菌體。對倒罐所排放的廢液應滅菌后才可排放。 5、選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種。 6、發(fā)現(xiàn)噬菌體停攪拌、小通風，將發(fā)酵液加熱到70~8

37、00C殺死噬菌體，才可排放。發(fā)酵罐周圍的管道也必須徹底滅菌。,發(fā)酵染菌及其防治,六、發(fā)酵染菌后的措施,染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學滅菌劑攪拌半小時，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會造成空氣的污染而導致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，對癥下藥，該罐也要徹底清洗，進行空罐消毒，才可進罐。染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛