遺傳性疾病的試驗(yàn)診斷

1、出生缺陷篩查與遺傳性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院樊綺詩,遺傳性疾病的分類,染色體病：在生殖細(xì)胞發(fā)生和受精卵早期發(fā)育過程中發(fā)生差錯，產(chǎn)生整條染色體或染色體節(jié)段超過或少于二倍體數(shù)，表現(xiàn)出先天發(fā)育異常單基因病：起因于致病基因，在一對同源染色體上可能其中一條帶有突變基因，也可能同源染色體上的對應(yīng)位點(diǎn)都是突變基因。有特征性家系傳遞格局,遺傳性疾病的分類,多基因病：亦稱多因子病，起因于遺傳素質(zhì)和環(huán)境因素，包括一些先天性發(fā)育

2、異常和常見病線粒體遺傳?。壕€粒體基因突變可導(dǎo)致線粒體遺傳病，隨線粒體傳遞，呈細(xì)胞質(zhì)遺傳體細(xì)胞遺傳病：癌腫起因于體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的突變，可表現(xiàn)出家族性癌腫遺傳易感性。有些先天畸形亦屬此類。,單基因遺傳病的分類,常染色體連鎖遺傳性疾?。褐虏』蛭挥诔Ｈ旧w性染色體連鎖遺傳性疾?。褐虏』蛭挥谛匀旧w,常染色體連鎖遺傳性疾病,常染色體連鎖隱性遺傳位于一對常染色體上的兩個等位基因均發(fā)生突變才能產(chǎn)生臨床癥狀，此時所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病稱為常染色

3、體連鎖隱性遺傳性疾病同一對染色體中只有一個等位基因發(fā)生突變的個體稱為雜合子，二個等位基因均發(fā)生突變的個體稱為純合子囊性纖維變：常染色體連鎖隱性遺傳(7q31),常染色體連鎖遺傳性疾病,常染色體連鎖顯性遺傳位于一對常染色體上的二個等位基因之一發(fā)生突變即產(chǎn)生臨床癥狀，所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病稱為常染色體連鎖顯性遺傳性疾病特點(diǎn)：家系中患者數(shù)目較多，大多情況下每一代均有患者Huntington舞蹈癥：常染色體顯性遺傳(4p16.3),性染色體

4、連鎖遺傳性疾病,X染色體連鎖遺傳大多為隱性遺傳 (如甲型血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥)顯性遺傳非常罕見Y染色體連鎖遺傳,產(chǎn)前篩查（診斷）,在胎兒出生前對其出生缺陷（包括先天異常和宮內(nèi)感染）進(jìn)行檢查產(chǎn)前篩查包括實(shí)驗(yàn)室檢測、影像學(xué)檢查等圍產(chǎn)醫(yī)學(xué),產(chǎn)前篩查的實(shí)驗(yàn)室檢測,染色體病的實(shí)驗(yàn)室篩查胎兒宮內(nèi)感染的實(shí)驗(yàn)室檢測遺傳性疾病的基因檢測,,染色體病的實(shí)驗(yàn)室篩查,,孕早期篩查（孕7～11周）孕中期篩查（孕15～20周）產(chǎn)前篩查只是對

5、胎兒罹患某一先天性或遺傳性疾病的風(fēng)險評估而非確診,中國出生缺陷現(xiàn)狀,中國每年約有100萬缺陷兒出生，其中只有30%可以治愈或糾正全國累計近3000萬個家庭曾生育過出生缺陷和先天殘疾兒，占全國家庭總數(shù)1/10中國每年出生約3-5萬唐氏兒，10萬神經(jīng)管缺陷患兒,,造成沉重的社會負(fù)擔(dān)和精神壓力此項支出每年達(dá)到300億每個唐氏患兒僅醫(yī)藥費(fèi)支出就達(dá)25萬1個患兒平均累及7個成人,關(guān)鍵在于預(yù)防,三級預(yù)防可大幅度減少出生缺陷兒的發(fā)生1級：

6、孕前保健2級：孕期保健(產(chǎn)前篩查與診斷)3級：新生兒篩查(早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)),篩查指征,危害嚴(yán)重發(fā)病率較高，人群分布明確篩查陽性有進(jìn)一步明確診斷方法篩查方法較簡易篩查費(fèi)用明顯低于治療費(fèi)用,孕期保健篩查的主要疾病,21-三體綜合癥，發(fā)病率為1/700~1/80018-三體綜合癥，發(fā)病率1/6000~1/8000開放性神經(jīng)管缺陷，發(fā)病率1/1000~1/2000,新生兒篩查的主要疾病,先天性甲狀腺功能低下苯丙酮尿癥先天性腎上

7、腺皮質(zhì)增生癥葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏采集一滴新生兒足跟末梢靜脈血于濾紙上，干燥后運(yùn)輸至篩查中心統(tǒng)一檢測。,血清學(xué)篩查的基本概念,安全性抽取孕婦 2ml靜脈血，通過測定血清中的特定標(biāo)志物，間接地判斷胎兒患遺傳缺陷疾病的風(fēng)險度非創(chuàng)傷性篩查對象原則上為孕9-20+6周的所有孕婦,血清學(xué)篩查的基本概念,孕婦自愿孕婦接受產(chǎn)前篩查遵循自愿原則，明確產(chǎn)前篩查的內(nèi)容、意義和相應(yīng)風(fēng)險，并簽署產(chǎn)血清學(xué)前篩查知情同意書篩查與確診篩查 (高

8、危)病例，需進(jìn)一步做絨毛膜(孕早期)或羊水穿刺(孕中期)做染色體核型分析進(jìn)行確診。,年齡曾是唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的指標(biāo),產(chǎn)前篩查的血清標(biāo)志物,1984年首次報道懷有染色體異常特別是DS胎兒的孕婦血清AFP水平偏低，建議將AFP作為35歲以下孕婦胎兒染色體異常的篩查指標(biāo)1987年報道懷有DS胎兒的母血中人絨毛膜促性腺激素（HCG）的水平是正常孕婦的2倍；非結(jié)合雌三醇（uE3）的水平比正常低25%，提示可以作為另兩個篩查指標(biāo)1991年報道

9、妊娠相關(guān)血漿蛋白A（ PAPP-A）與DS有關(guān)1996年，抑制素A (inhibin A)成為第四個血清檢測指標(biāo),,以上單個指標(biāo)進(jìn)行唐氏綜合征的篩查，檢出率均太低(30%左右)將AFP、HCG、uE3和Inhibin A四項指標(biāo)聯(lián)合檢測稱為四聯(lián)篩查對14-20周的孕婦進(jìn)行篩查，檢出率為81%，假陽性率約5%,,目前國內(nèi)孕中期血清學(xué)產(chǎn)前篩查模式 (Second-trimester maternal serum scre

10、ening) AFP + free βHCG/HCG AFP + free βHCG/HCG + uE3 AFP + free βHCG/HCG + uE3 + Inh A,全球篩查模式,我國開展篩查的現(xiàn)狀及可選方案,,我國開展現(xiàn)狀：對孕早期篩查的重要意義認(rèn)識不足，孕中期篩查仍為主流孕早期篩查技術(shù)不成熟，尤其規(guī)范NT檢測有相當(dāng)難度大多數(shù)孕婦孕中期才參加產(chǎn)前保健大多數(shù)中心僅限于傳統(tǒng)的中期兩項篩查產(chǎn)

11、篩質(zhì)量管理意識有待加強(qiáng),,針對我國國情推薦參考方案：積極宣傳孕早期篩查的重要意義，產(chǎn)篩未來發(fā)展趨勢在不具備規(guī)范NT檢測情況下，建議進(jìn)行孕中期四聯(lián)篩查，使其成為國內(nèi)產(chǎn)篩的基礎(chǔ)性工作有條件的地區(qū)開展酌情、序貫或血清整合等多種模式篩查，為孕婦提供更多選擇,,胎兒宮內(nèi)感染的實(shí)驗(yàn)室檢查,TORCH綜合征的孕前和產(chǎn)前檢測,TORCH綜合征是病原微生物感染引起胎兒異常的一組疾病 弓形蟲（toxoplasma, TOXO）

12、 風(fēng)疹病毒（rubella virus, RV） 巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus, CMV） 單純皰疹病毒（herpes simple virus, HSV） 其他病原微生物（other, O）,,孕婦為易感人群，感染途徑與一般人相同可發(fā)生在妊娠各期，宮內(nèi)感染可造成嚴(yán)重后果感染后除免疫缺陷者外，機(jī)體均產(chǎn)生特異性抗體。采集孕婦外周血檢測相關(guān)病原體的特異性抗體 Ig

13、G 和 IgM，以判斷孕婦是否曾經(jīng)或正在感染某一病原體,,抗體檢測：免疫學(xué)方法血清學(xué)檢測的局限性 抗體產(chǎn)生時間 判斷胎兒感染須謹(jǐn)慎 孕前篩查更為重要 免疫缺陷者可能檢測不到相應(yīng)抗體,,單基因遺傳病的基因診斷,單基因遺傳病中常見的分子異常,遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個（或數(shù)個）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變，而發(fā)病是通過遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶）的表現(xiàn)異常所致。基因突變主要包括

14、點(diǎn)突變、片段性突變和動態(tài)性突變。,點(diǎn)突變 (point mutation),包括錯義突變、無義突變、移碼突變各種點(diǎn)突變所造成的后果： 蛋白質(zhì)分子量改變 蛋白質(zhì)合成量下降 無蛋白質(zhì)合成,,片段性突變(fragememtal mutation),核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來不在

15、一起的基因由于某些原因重新排列,動態(tài)性突變(dynamic mutation),以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞過程中 不穩(wěn)定，會發(fā)生擴(kuò)展，即子代的重復(fù)次數(shù)往 往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復(fù) 少年脊髓型共濟(jì)失調(diào)：GAA重復(fù) 亨廷頓?。篊AG重復(fù),X染色體（xq27.3）的脆性位點(diǎn),脆性X綜合征是遺傳性智力缺陷最常見的一種。致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷

16、酸重復(fù) 區(qū)。普通男性群體中的患病率為1/4000。普通女性群體中的患病率為1/6000?；颊咧橇Φ拖?、語言障礙、行為異常、呈特殊 面容。,正常個體：CGG重復(fù)次數(shù)6~52次，中國人群以(CGG)28為多見。前突變(premutation)： (CGG) 53~230為攜帶者，雖表型正常，但在傳遞過程中易發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展，使后代的CGG重復(fù)次數(shù)大大增加，并有異常表型。全突變： (CGG) ≥230時，100%的男性表

17、現(xiàn)為典型的脆性X綜合征, 53%的女性表現(xiàn)為程度不同的智力低下。,遺傳性疾病基因診斷的策略,（一）直接診斷策略 基因診斷的直接策略是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,直接診斷常用技術(shù),Southern 印跡技術(shù)將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶水解，經(jīng)凝膠電泳分離用堿處理使凝膠中的DN

18、A變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上用標(biāo)記的特異性探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影實(shí)驗(yàn)結(jié)果為限制性長度片段多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP）,直接診斷常用技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）在突變點(diǎn)二側(cè)設(shè)計引物，經(jīng)擴(kuò)增后可得含有突變點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物以突變篩查技術(shù)找出突變點(diǎn)　 SSCP、DGGE

19、 Melting curve analysis DNA sequencing,DMD的基因檢測,Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一種 高發(fā)病率、高致殘、高致死的X 連鎖的遺傳性疾病，平均每3500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者DMD基因的全長為250kb，有79個外顯子DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占突變的60%~70%用多重PCR技術(shù)對外顯子進(jìn)行篩查,DMD基因外顯子的檢測

20、,,（二）間接診斷策略,間接診斷是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過分析可確定個體來自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體（與致病基因連鎖），從而判斷該個體是否帶有致病基因 間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性估計被檢者患病的可能性,遺傳標(biāo)志及其多態(tài)性,單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%~80%)在單倍體中都為單拷貝,重復(fù)序列,真核生物染色體DNA中存在許多不同程度

21、的重復(fù)序列，按照孟德爾遺傳定律傳遞大多存在于基因的非編碼區(qū)根據(jù)DNA序列重復(fù)出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類型,,中度重復(fù)序列,短分散片段(short interspersed segments, SINEs)平均長度300bp，拷貝數(shù)可達(dá)10萬左右長分散片段(long interspersed segments, LINEs)平均長度3500~5000bp，拷貝數(shù)達(dá)1萬左右在人類基因組中約占12%,中度重復(fù)序列,大多數(shù)不編碼蛋白質(zhì),

22、與單拷貝基因間隔排列有些是編碼蛋白質(zhì)或RNA的結(jié)構(gòu)基因（HLA、rRNA、tRNA、組蛋白、免疫球蛋白基因）可存在于結(jié)構(gòu)基因之間、基因簇之中、內(nèi)含子內(nèi)部,高度重復(fù)序列,存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復(fù)頻率可高達(dá)106 以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標(biāo)志，已廣泛用于基因定位和基因診斷,,小衛(wèi)星序列也稱數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR)

23、以6-70bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列,,微衛(wèi)星序列 (microsatellite)又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)以2-6bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性,,堿基組成不同于其他部分，用密度梯度離心可將其與主體DNA分開,重復(fù)序列的檢測,PCR技術(shù)在重復(fù)序列二側(cè)設(shè)定引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增用凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)產(chǎn)物片段大小即可決定重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù),遺傳咨詢和

24、產(chǎn)前基因診斷,遺傳咨詢明確診斷先證者，確定引起疾病的分子異常了解本病傳遞至下代的風(fēng)險率判斷胎兒是否患病,遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷,產(chǎn)前基因診斷羊水細(xì)胞（16~20周）絨毛膜細(xì)胞（8~12周）非創(chuàng)傷性取樣母體外周血中胎兒游離DNA,遺傳咨詢戰(zhàn)略路線（以DMD為例）,MD是否由Dystrophin缺陷所致?,,是。孕婦是否攜帶者？,,,是?；蚩赡苁?。胎兒性別？,,,,男孩。分子生物學(xué)研究,不是。尋找引起本病的原因,不是。不進(jìn)行

25、產(chǎn)前基因診斷，但應(yīng)研究家系中其他有風(fēng)險者,女孩。不進(jìn)行分子生物學(xué)研究,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C4

26、5: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,,12212,C50: C49: C45:

27、 C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,1

28、8,19,20,21,22,23,,,,,,,DMD家系分析,,,,1,2,,,,,,,,,,,,,,,5.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8

29、 4.8 5 5 5,5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8

30、 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5,1 2 3 4,,,,,,,血友?。良蚁捣治?間接診斷的不確定性,遺傳標(biāo)志所帶的信息性有限（多態(tài)性程度不高）新突變基因重組（若遺傳標(biāo)志離致病基因的遺傳距離

31、為5cM, 此時基因重組的可能性為5%）家系成員不完整,,單基因病遺傳缺陷的實(shí)驗(yàn)診斷,肢帶型肌營養(yǎng)不良 (LGMD2) 是一類常染 色體連鎖隱性遺傳病，已有LGMD2A~2H8 種類型。由于遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)具高度異質(zhì)性，臨床診斷和分類十分困難,家系資料,致病基因的定位,用已報道的 LGMD2A~2H 8個基因所在位點(diǎn)附近共14個STR標(biāo)記對家系成員DNA樣本進(jìn)行連鎖分析，尋找與該家系連鎖的致病基因,致病基因定位結(jié)果,D2S377位點(diǎn)的

32、Lod Score值為1.85D2S286位點(diǎn)的Lod score值為0.51其他各位點(diǎn)的值均為負(fù)數(shù) Lod score值1： 支持連鎖Lod score值>3： 強(qiáng)烈支持連鎖,致病基因編碼產(chǎn)物檢測結(jié)果,先證者LGMD2B的基因編碼蛋白dysferlin條帶密度與正常對照相比有明顯下降其余各蛋白條帶與正常對照相比無明顯改變,DYSF--LGMD2B的致病基因,DYSF基因全長150kb，有55個外顯子cDNA長

33、度為6.9kb，含有一個6243bp的開放讀碼框，編碼2080個氨基酸,DYSF基因突變的檢測,在DYSF基因的突變熱點(diǎn)區(qū)篩查，以期發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 dysferlin缺陷的基因突變逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物克隆至載體后作序列分析,G,,DYSF基因檢測結(jié)果,cDNA第6425/6426位(52號外顯子) 缺失 1個G堿基 (6425/6426 del G)第2019位密碼子agg agc，下游讀碼發(fā)生移位，使第2035位密碼子atg