肝衰竭機制及治療進展

1、肝衰竭機制及治療進展,中山大學附屬第三醫(yī)院感染科高志良 教授,中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭 （liver failure, LF）,中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭一、肝細胞死亡的發(fā)生機制肝細胞死亡超過了肝臟的再生能力，即會發(fā)生肝衰竭經(jīng)典的肝細胞死亡模式分為兩類，即壞死與凋亡壞死往往繼發(fā)于各種肝損傷所導致的ATP 耗竭，細胞腫脹溶解，導致胞內(nèi)容物的釋放和繼發(fā)性炎癥反應的發(fā)生凋亡為ATP 依賴的程序性細胞死亡方式，

2、其細胞因皺縮而獨立出來，染色質(zhì)固縮，DNA 斷裂成規(guī)律性片段，并被胞膜包繞形成凋亡小體，后者可由鄰近巨噬細胞吞噬，以最大限度的減輕細胞內(nèi)容物的滲漏和炎癥反應肝臟病理中我們可以觀察到肝細胞的壞死與凋亡是并存的。研究證據(jù)提出新的觀點，壞死與凋亡是源于相同啟動因素和信號轉(zhuǎn)導途徑的不同的細胞死亡方式，這一過程被命名為壞死性凋亡。,中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭細胞腫脹是壞死早期最為顯著的特征在ATP 耗竭后，肝細胞骨架蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變

3、，促成漿膜大泡的形成。隨即出現(xiàn)以線粒體去極化、溶酶體破裂、雙向陰離子熒光團泄漏及漿膜大泡腫脹加劇為特征的亞穩(wěn)態(tài)。該狀態(tài)持續(xù)幾分鐘后漿膜大泡破裂，導致漿膜滲透壓屏障不可逆的損傷，各種跨膜電子、離子梯度的斷裂，以及溶質(zhì)酶和代謝中間產(chǎn)物的滲漏，最終細胞失去活性,中山大學附屬第三醫(yī)院,病 因,中山大學附屬第三醫(yī)院,傳統(tǒng)治療,一、內(nèi)科綜合治療(抗病毒治療)二、免疫調(diào)節(jié)治療三、并發(fā)癥的治療,中山大學附屬第三醫(yī)院,治療現(xiàn)狀,一、人工肝二、肝移植

4、三、細胞治療,中山大學附屬第三醫(yī)院,我科治療現(xiàn)狀,中山大學附屬第三醫(yī)院,1998~2004年我科肝衰竭治療效果情況,我科治療現(xiàn)狀,中山大學附屬第三醫(yī)院,1998~2004我科治療肝衰竭的有效率（治愈率+好轉(zhuǎn)率）,New strategy 乙肝肝衰竭的時相分層治療新策略 2008年,中山大學附屬第三醫(yī)院,策略簡介,以肝臟為主體對象的肝衰竭時相分層治療新策略 以肝外臟器為主題對象的并發(fā)癥干預新策略,中山

5、大學附屬第三醫(yī)院,層次觀點,病因治療層面：全程監(jiān)控——抗病毒 病理生理層面：以控制過激的免疫攻擊為基礎，以肝細胞修復治療（干細胞移植）為終極目標，并輔以肝外臟器的穩(wěn)定治療。,中山大學附屬第三醫(yī)院,研究方案,中山大學附屬第三醫(yī)院,創(chuàng)新點,,本項目在國內(nèi)外:首次宏觀、全面的對乙肝肝衰竭的病程 進行監(jiān)控和處理。從觀念上更新乙肝治療的策略與方法。,中山大學附屬第三醫(yī)院,中山大學附屬第三醫(yī)院,以肝臟為主體對象的肝衰竭時相新觀點,中山

6、大學附屬第三醫(yī)院,慢性肝衰竭上升期三重打擊學說,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打擊 –免疫損傷,以CTL為中心的細胞免疫： 免疫效應細胞，CD8+CTL； 靶抗原，HBcAg、HBeAg、pre-S1、S2 I類MHC分子。肝細胞凋亡途徑： 穿孔素顆粒酶系統(tǒng)； Fas系統(tǒng)； TNF系

7、統(tǒng)； TRAIL。,,,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打擊 –免疫損傷,盡管TRAIL 介導的細胞凋亡途徑已被闡明，但其是否與Fas-L、TNF-α 途徑一樣在急性肝衰竭的疾病進程中發(fā)揮重要作用尚不明確體內(nèi)外研究表明正常肝細胞對于TRAIL 介導的凋亡反應耐受，而慢性病毒感染、脂肪變性及毒性物質(zhì)的刺激卻可上調(diào)肝細胞TRAIL 的表達，進而通過TRAIL 配體/受體系統(tǒng)特異性清除病毒感染的肝細胞或肝癌細胞TRAIL 配體/受體途

8、徑對于肝細胞選擇性誘導凋亡的作用為病毒性肝炎與肝膽管系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供了潛在的治療靶點。,,,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打擊 –免疫損傷,持續(xù)的HBV復制嚴重損傷了病毒特異性T細胞功能，包括 增殖和分泌細胞因子IL-2、IFN-r和INF-a的能力。 這種T細胞的功能損傷稱之為功能耗竭(exhausition)， 可能與抗原提呈細胞（主要是DC）功能低下、調(diào)節(jié)性T細 胞（Regulatory T cells ，

9、Tregs）增多以及抑制性受 體的高表達有關。 CD28家族的程序性死亡受體1（PD-1）分子可作為這些功 能耗竭的T細胞重要標志。,Zhang Z et al.J Hepatol 2007，47：751-759Xu DP et al.J Immunol ,2006,177(13):739-747Chen L et al.Nat Rev Immunol,2004,4(5):336-347,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打

10、擊 –免疫損傷,缺乏PD-1表達將會失去對T細胞反應過強的控制，從而誘 發(fā)免疫病理損傷，促進急性肝衰竭的發(fā)生。,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打擊 –免疫損傷,Radziewicz H et al.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171,當肝臟炎性反應輕微時，肝內(nèi)T細胞低表達PD-1，同時肝 細胞也低表達PD-L1，這樣TCR信號可誘導T細胞發(fā)生正常 的免疫應答。 當肝臟炎性反應增強

11、時，肝內(nèi)增強的PD-1/PD-L1信號途徑 就會抑制并損傷T細胞反應。 當肝臟炎性反應進一步增強時，肝內(nèi)的PD-1/PD-L1信號途 徑就會提高反應性T細胞凋亡敏感性，從而抑制免疫應答。,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打擊 –免疫損傷,Radziewicz H et al.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171,中山大學附屬第三醫(yī)院,第一重打擊 –免疫損傷,PD-1/PD-L1結(jié)合可能通

12、過兩條途徑來抑制肝內(nèi)T細胞反應： 通過磷酸化接頭蛋白減弱TCR信號、降 低T細胞功能； 干擾細胞周期，提高細胞凋亡敏感性。,Radziewicz H et al.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171,中山大學附屬第三醫(yī)院,,第一重打擊 –免疫損傷,肝細胞內(nèi)病毒的復制誘導產(chǎn)生多種細胞因子，以TNF-α為核心的炎癥反應，包括TGF-β1對肝細胞再生的抑制作用， TNF-α、IFN-γ、

13、IL-6、IL-8水平的升高。另外，IL-15和NK細胞也可能在重型肝炎發(fā)病中起一定的作用。,中山大學附屬第三醫(yī)院,第二重打擊 –缺血缺氧,,,與其它高需氧的組織器官類似，肝臟對供血不足引起的損傷極為敏感。其中低流量性缺血，即血供被完全阻斷時，整個肝臟將處于缺氧狀態(tài)。而低流量性缺氧，即仍有血供但不足以滿足氧需時，肝小葉中央?yún)^(qū)域而非周邊區(qū)域?qū)l(fā)生缺氧。由于肝臟具有雙重血供系統(tǒng)，由低流量性缺氧造成的中央?yún)^(qū)域肝細胞的壞死是更為常見的現(xiàn)象。,中

14、山大學附屬第三醫(yī)院,第二重打擊 –缺血缺氧,,缺氧條件下肝臟微循環(huán)的紊亂導致肝臟損傷一系列肝臟損傷的啟動因素去除后，ALT/LDH指標持續(xù)低下預示肝臟缺血存在巨噬細胞的過度激活在急性肝衰竭病人的進展中起關鍵性的作用，肝臟中活化和增殖的巨噬細胞損傷內(nèi)皮細胞，擾亂肝臟微循環(huán)。,Kazuhiro Kotoh, Hepatology 2008, 7:6,中山大學附屬第三醫(yī)院,第二重打擊 –缺血缺氧,,Kazuhiro Kotoh等回顧性研究了日

15、本33例急性肝臟損傷病人，分為存活組和死亡組病人入院后第三天ALT/LDH指標與MELD評分ROC曲線下面積分別為0.893、0.777存活組在LDH達到高峰之后，ALT/LDH指標迅速增高死亡組LDH延遲降低，ALT/LDH指標低，由肝臟微循環(huán)紊亂引起,Kazuhiro Kotoh, Hepatology 2008, 7:6,中山大學附屬第三醫(yī)院,第二重打擊 –缺血缺氧,,Lorrie A.等研究了細胞信號抑制因子的表達與小鼠肝

16、臟缺血再灌注損傷嚴重性的關系TNF、IL-1β、IL-6和IFNγ通過JAK-STAT通路對缺血再灌注損傷有重要的作用,Lorrie A.Journal of Hepatology 49 (2008) 198–206.,這項研究第一次揭示了肝臟缺血再灌注損傷進展之間的關系，前炎癥介質(zhì)的誘導及負信號調(diào)節(jié)機制的活化GPT的清除，僅僅表示肝細胞很少繼續(xù)壞死，不能預示恢復,細胞因子在不同時間的表達支持動態(tài)調(diào)控機制的出現(xiàn)SOCS3在肝臟

17、缺血再灌注中參與急性調(diào)節(jié)，輕微的損傷SOCS3能夠控制細胞因子的表達SOCS1的誘導是一種輔助的調(diào)控機制,肝臟缺血再灌注后，IL-6是SOCS1、 SOCS3的主要誘導物 在外傷和多器官功能衰竭的病人中，IL-6 作為損傷嚴重性和死亡率的潛在性標記,高IL-6水平與預后差存在相關性，標志著負調(diào)節(jié)機制不足多器官功能衰竭時，負調(diào)節(jié)機制在局部或偏遠損傷時誘導不充分，阻礙內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及抑制炎癥的進展,中山大學附

18、屬第三醫(yī)院,第三重打擊 –內(nèi)毒素血癥,激活枯否細胞,,,細胞因子（ TNF…）炎性介質(zhì)（PAF…）NO，內(nèi)皮素，自由基，etc,微循環(huán)障礙,,,,肝損害,Han DW et al. World J Gastroenterol,2002,12,(8);961-966,內(nèi)毒素,,中山大學附屬第三醫(yī)院,第三重打擊 –內(nèi)毒素血癥,肝臟,內(nèi)毒素,腸道菌群失調(diào) 腸道屏障,肝臟解毒功能 門脈高壓,中山大學附屬第三醫(yī)院,第三重打擊

19、 –內(nèi)毒素血癥,,內(nèi)毒素,經(jīng)典途徑：classical CD14 dependent pathway旁路途徑： other pathway-sCD14 LBP：LPS binding protein Grace LS, et al. Hepatology 2000; 31: 932-936,Uesugi T, e

20、t al. Role of Lipopolysaccharide-Binding Protein in Early Alcohol-Induced Liver Injury in Mice [J]. J Immunol. 2002 ;168(6):2963-9,中山大學附屬第三醫(yī)院,第三重打擊 –內(nèi)毒素血癥,SCHÄFER C, et al, 2002, 37,(1), : 81–86.,中山大學附屬第三醫(yī)院,第三重打擊

21、–內(nèi)毒素血癥,Uesugi T, et al. J Immunol. 2002 ;168(6):2963-9,LBP KO: LBP knockout mice.,中山大學附屬第三醫(yī)院,,,LPS刺激肝組織后分泌TNFα,IL-1增多,P.Olinga,et.Journal of Hepatoloty. 2001(35:187-194),第三重打擊 –內(nèi)毒素血癥,中山大學附屬第三醫(yī)院,,第三重打擊 –內(nèi)毒素血癥,---P.Olinga,

22、et Journal of Hepatoloty. 2001(35:187-194) ---Knolle P,et al. J Hepatol. 1995;22(2):226-9,LPS刺激肝組織后分泌IL-6,IL-10增多,中山大學附屬第三醫(yī)院,,第三重打擊 –內(nèi)毒素血癥,TNF導致肝細胞調(diào)亡/壞死,Qing Zang G,et al. World J Gastroentero, 2000; 6(5):688-692,6 ho

23、urs after GalN/TNF-α, a greatnumber of apoptotic liver cells are found,Apoptotic cells (a), apoptotic bodies (b), leukocytes (l) and necrosis (n).,9 hours after GalN/ET, further increase of apoptotic liver cells and pie

24、ces of liver cell necrosis and bleeding with leukocytes infiltration appear.,Qing Zang G,et al. Effect of hepatocyte apoptosis induced by TNF-αon acute severe hepatitis in mouse models [J]. World J Gastroentero, 2000; 6(

25、5):688-692,TNFα抗體可阻斷內(nèi)毒素所引起的肝損害,Analysis of DNA ladder from liver cell extract.,,Marker ET 6h TNF 9h ET 9h,,,Marker,,,,TNF 6 h,,Anti-TNF-α/ET 9h,——TNF,一種適用于慢加急性肝衰竭預后評估并且優(yōu)于MELD的評分系統(tǒng)研究目的：試圖建立一種適

26、用于慢加急性肝衰竭預后評估并且優(yōu)于終末期肝病模型(MELD)的評分系統(tǒng)。,中山大學附屬第三醫(yī)院,研究背景：全國慢性乙型肝炎病人約2800萬約1％病人在病程中發(fā)生慢加急性肝衰竭晚期慢加急性肝衰竭死亡率大于80％,中山大學附屬第三醫(yī)院,,直到目前為止，對乙型肝炎慢加急性肝衰竭包括核苷類似物抗乙型肝炎病毒的內(nèi)科綜合治療或加上人工肝支持系統(tǒng)治療，僅對于有足夠肝再生能力的病人才能奏效；而無足夠肝再生能力的病人只能進行肝移植治療才能挽救生命。

27、然而，供肝缺乏，術后長期抗排斥和抗乙型肝炎病毒治療，以及手術費用高昂等因素限制了肝移植治療的臨床應用范圍。因此，臨床上迫切需要建立一種客觀，簡便和敏感的評分方法來幫助臨床醫(yī)生評估乙型肝炎慢加急性肝衰竭病人是選擇內(nèi)科綜合治療或/加上人工肝支持系統(tǒng)治療，還是進行肝移植治療。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,研究方法： 對死亡組196例和存活組203例慢加急性肝衰竭進行MELD評分，同時選擇凝血酶原活動度、肌酐、肝性腦病、并發(fā)感染、血清總血清膽

28、紅素、肝臟大小和腹水等7個肝衰竭相關的臨床指標，按照嚴重性給以1～4分并合計總分，然后比較這兩種評分系統(tǒng)的異同。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,注：感染的評分： 1～3分均以白細胞（WBC）計數(shù)或中性粒細胞（N）的百分比，先達到者為準計分。 4分的標準為：凡有肺部炎癥的影像學改變，無論其白細胞和中性粒細胞的值為多少，均計為4分。,表2. 本評分系統(tǒng)與MELD評分結(jié)果,本評分系統(tǒng)t值26.13大于MELD評分t值16.57；R

29、OC曲線下面積分析表明本評分系統(tǒng)比MELD能更準確地預測預后。,,,用ROC曲線比較MELD和本評分系統(tǒng)的預測能力：兩者的分值均能夠非常好的預測慢性乙型重型肝炎患者的死亡率MELD和簡易評分系統(tǒng)的曲線下面積（c-statistic）分別為0.886(95％ C值可信區(qū)間為0.852-0.920)和0.960 (95％ C值可信區(qū)間為0.944-0.977)，兩者的95％可信區(qū)間無重疊，有統(tǒng)計學意義本評分系統(tǒng)對慢性乙型重型肝炎預后的

30、預測能力明顯優(yōu)于MELD系統(tǒng)(圖3)。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,圖3. MELD與本評分ROC曲線圖,結(jié)論 與MELD評分相比較本研究增加了肝臟縮小，腹水，肝性腦病和感染4個臨床指標參與慢加急性肝衰竭的評估，提高本評分系統(tǒng)的敏感性，更適用于慢加急性肝衰竭預后評估。本評分系統(tǒng)是一種敏感性優(yōu)于MEID評分的客觀，簡易的評分系統(tǒng)。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,慢性乙型肝炎自然病程中從肝纖維化第1期到4期血清HBV DNA水平逐漸下降，而

31、由相同肝實質(zhì)體積分攤后沒有變化研究背景在慢性乙型肝炎的初期，血清HBV DNA水平處于高水平；相反，在肝纖維化，肝硬化和肝細胞癌時血清HBV DNA的水平處于較低水平。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,研究目的弄清慢性乙型肝炎自然病程中從肝纖維化1期～4期血清HBV DNA水平的變化動態(tài)，以及不同肝纖維化分期用相同肝實質(zhì)體積分攤后的變化動態(tài)。研究方法從1期～4期肝纖維化的面積，推算肝纖維化1期～4期的肝實質(zhì)體積比例見示意圖1。,中山

32、大學附屬第三醫(yī)院,,研究結(jié)果 1．慢性乙型肝炎自然病程中從肝纖維化1期～4期的血清HBV DNA水平變化動態(tài)，以及用相同肝實質(zhì)體積分攤后的變化動態(tài)見表1：,2．慢性乙型肝炎自然病程中從肝纖維化1期～4期的血清HBV DNA水平變化動態(tài)，以及用相同肝實質(zhì)體積分攤后的變化動態(tài)的統(tǒng)計學分析見表2：表2可見：從肝纖維化1期～4期血清HBV DNA逐漸下降有統(tǒng)計學差異，但是，用相同肝實質(zhì)體積分攤后，4期之間沒有存在差異。,結(jié)論在慢性乙型肝炎

33、的自然病程中，從肝纖維化1期～4期血清HBV DNA水平逐漸下降與肝實質(zhì)體積的逐漸縮少造成提供給HBV復制的場所減少有關。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,恩替卡韋在乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭中的應用研究,中山大學附屬第三醫(yī)院,,目的 觀察恩替卡韋治療對乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭患者生存率的影響。 方法 84例治療組乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭患者在常規(guī)內(nèi)科治療基礎上加用恩替卡韋0.5mg/天治療，99例對照組患者采用常規(guī)

34、內(nèi)科治療，觀察患者存活情況、肝功能生化學指標、HBVDNA定量、凝血酶原時間，比較兩組患者在早期、中期、晚期各期肝功能衰竭生存率的差異。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,結(jié)果 在早期慢加急性肝功能衰竭患者中，治療組存活率為63.27%（31/49），高于對照組存活率39.66%(23/58)，P=0.015。在中期慢加急性肝功能衰竭患者中，治療組存活率為62.96%(17/27)，高于對照組存活率35.14%(13/37)，P＝0.028。在

35、晚期肝功能衰竭患者中治療組存活率50％（4/8），對照組為25％（1/4），兩組比較無顯著性差異（P＝0.408）。在血清總膽紅素大于342μmol/l的患者中，治療組存活率為56.00％，高于對照組(26.79％),P＝0.002。在治療4周時，治療組HBVDNA載量下降3.95log10 copies/mL，高于對照組1.78 log10 copies/ml（P=0.001）。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,表1 患者人口學及治療前基

36、線情況(±S) 治療組 對照組例數(shù) 84 99性別（男/女） 76/8 88/11 χ2＝0.123 P＝0.726年齡（歲）

37、 40.20±10.64 39.54±10.46 t=0.427 P=0.670TBili(μmol/l) 386.18±183.48 403.11±180.09 t=0.628 P=0.531ALT (U/l) 510.75±697.50 4

38、88.75±612.89 t=0.238 P=0.812AST(U/l) 419.90±513.35 354.59±386.00 t=0.981 P=0.328ALB (g/l) 33.79±5.11 32.51±4.66 t=

39、1.764 P=0.079PT (sec) 29.33±10.18 29.09±6.61 t=0.192 P=0.848HBeAg陽性率（％）29.76 26.26 χ2＝0.277 P＝0.599HBV DNA

40、4.976±2.855 3.944±2.662 t=2.527 P=0.012(log10 copies/ml),中山大學附屬第三醫(yī)院,,中山大學附屬第三醫(yī)院,恩替卡韋治療乙型肝炎早期慢加急性肝功能衰竭患者的生存分析,結(jié)論在乙型病毒性肝炎慢加急性早期及中期肝功能衰竭患者中，采用恩替卡韋抗病毒治療能提高生存率，在晚期肝功能衰竭患者中需加大樣本量進一步研究。在總膽紅素水平高于

41、342μmol/l的患者中，恩替卡韋抗病毒治療能提高患者生存率。,中山大學附屬第三醫(yī)院,,干細胞基礎研究及 臨床應用（肝衰竭治療）進展,中山大學附屬第三醫(yī)院,研究背景,中山大學附屬第三醫(yī)院,干細胞(stem cell)是目前醫(yī)學、生物組織工程學等領域研究的熱點之一;間充質(zhì)干細胞(MSCs) 具有多向分化潛能和體外穩(wěn)定擴增能力, 廣泛應用于心血管、骨骼、 神經(jīng)、造血及腎臟系統(tǒng)疾病的治療;,Heydarkhan-HS, et al.

42、 Cell Tissues Organs, 2008; 187(4): 263.Sabrina C, et al. Cell Biol Int, 2007; 31(8): 845.Perin L, et al. Pediatr Res, 2008 Jan 24,研究背景,中山大學附屬第三醫(yī)院,MSCs 在肝臟病治療中的應用 2006年英國科學家首先利用臍帶血干細胞培育 人類肝臟組織 2008年臺灣學者通過脾內(nèi)和靜脈注射

43、, 采用不 同劑量的MSCs治療肝衰竭的免疫缺陷小鼠顯示: MSCs能有效地修復肝損傷,Pai M, et al. Am J Gastroenterol , 2008 Jun 30. Kuo T K. et al. Gastroenterology. 2008; 134(7): 2111-21,研究背景,中山大學附屬第三醫(yī)院,Banas A etal. J Gastroenterol Hepatol. 2008 Jun 25

44、. Poll D v et al. Hepatology. 2008; 47(5): 1634-43,最近日本W(wǎng)aseda(早稻田)大學研究者在體外和動物體內(nèi)驗證: MSCs具有較強的肝細胞分化特性以及較好的肝損傷修復作用。美國Harvard大學的學者在近期Hepatology上報道: MSCs分泌的細胞因子在大鼠體內(nèi)能促進肝細胞再生和抑制調(diào)亡。,研究背景,中山大學附屬第三醫(yī)院,自體MSCs避免: 免疫排斥反應和倫理學限制, 具有良

45、好應用前景.英國倫敦帝國醫(yī)學院應用自體MSCs對慢性肝病的臨床治療顯示: 1. 該方法是安全的, 有效的,未見任何并發(fā)癥; 2. 臨床癥狀明顯改善, 隨訪12個月～18個月未見腫瘤形成.,Levicar N. et al. Cell Prolif. 2008; 41 Suppl 1:115-25,研究背景,中山大學附屬第三醫(yī)院,印度Hyderabad醫(yī)院通過肝動脈注入自體MSCs治療慢性肝衰竭和肝硬化臨床研究顯示:

46、 自體MSCs是安全和有效的,A.A. Khan etal. Transplantation Proceedings, 40, 1140–44,基礎研究,中山大學附屬第三醫(yī)院,1.正常成人MSCs 2.肝衰竭患者MSCs 3.羊水干細胞 4.肝衰竭肝勻漿蛋白對MSCs肝細胞分化 影響,基礎研究（1）,中山大學附屬第三醫(yī)院,正常MSC的分離，純化，擴增,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Ce

47、ll Biol Int .2008,32,基礎研究（1）,中山大學附屬第三醫(yī)院,MSC向肝細胞分化技術成熟,Chan xie, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,40,基礎研究（1）,中山大學附屬第三醫(yī)院,MSC向肝細胞分化誘導,Chan xie, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,40,基礎研究（2）,中山大學附屬第三醫(yī)院,乙肝肝衰竭患者MSCs的HBV感染狀況研

48、究,基礎研究（2）,中山大學附屬第三醫(yī)院,對乙肝患者的BMSCs安全性檢測(免疫組化),Chan xie, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,40,基礎研究（3）,中山大學附屬第三醫(yī)院,羊水MSCs與骨髓MSCsOct-4基因表達水平的比較,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基礎研究（3）,中山大學附屬第三醫(yī)院,羊水MSCs與骨髓M

49、SCs向肝細胞誘導分化能力的比較,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基礎研究（3）,中山大學附屬第三醫(yī)院,羊水MSCs與骨髓MSCs細胞遺傳學部分研究,Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int .2008,32,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭模型大鼠血清、肝勻漿中促進/抑制肝細胞再生蛋白的分析,基礎研究（4）,

50、中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭模型血清和肝勻漿誘導大鼠骨髓MSCs向肝細胞分化,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭模型血清和肝勻漿對大鼠骨髓MSCs體外增殖的影響,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,凝膠層析法分離純化正常大鼠與肝衰竭肝勻漿蛋白,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,凝膠層析法分離純化正常大鼠與肝衰竭血清蛋白,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,肝衰竭肝勻漿蛋白成分聚丙酰胺凝膠電泳,基礎研究（4）,中山大學附

51、屬第三醫(yī)院,第1波峰:集中在260KD～50KD； 第2波峰蛋白主要集中在220KD～50KD; 第3波峰蛋白主要集中在85KD～15KD； 第4波峰蛋白主要集中在85KD～12KD; 第5、第6波峰的蛋白在電泳中沒有蛋白條帶,聚丙酰胺凝膠電泳蛋白條帶大致分布,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,初步分離純化肝衰竭肝勻漿蛋白對大鼠骨髓MSCs體外增殖的影響,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,初步分離純化肝衰竭肝勻

52、漿蛋白對大鼠骨髓MSCs體外肝細胞分化誘導,基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,分離純化后肝勻漿蛋白對MSCs作用發(fā)現(xiàn):,既有促進MSCs肝細胞的分化(促分化作用); 同時還有對MSCs增殖有抑制作用(毒性作用); 提示肝衰竭患者的血漿和肝臟存在: 內(nèi)促進/抑制肝細胞再生蛋白成分失衡,(已整理成文待發(fā)表),基礎研究（4）,中山大學附屬第三醫(yī)院,(展望),進一步分離血清及肝勻漿中促進MSC向肝細胞分化的蛋白和對增殖抑制的蛋白

53、;尋找具體的目的蛋白質(zhì)，并進行蛋白測序和鑒定;分離純化后蛋白應用于人工肝和臨床治療.,臨床研究,第一代：自體MSCs移植治療肝衰竭(已施行)第二代：自體MSCs體外培養(yǎng)增殖后移植治療 肝衰竭（研究中）第三代：干細胞誘導分化為肝細胞后移植治療 肝衰竭（研究中）第四代：各種干細胞（羊水干細胞、異體干細 胞等）的移植治療肝衰竭（設計中）,中山大學

54、附屬第三醫(yī)院,第一代：MSCs自體移植治療肝衰竭 本科室自2005年9月起開始自體MSCs移植治療肝衰竭的實施與研究，至2006年6月共進行32例，收到明顯效果。,中山大學附屬第三醫(yī)院,流 程,病例選擇→知情同意→患者準備→采集骨髓→MSCs分離→自體回輸移植自體回輸移植： 1、經(jīng)介入途徑由股動脈到達肝固有動脈 2、B超引導下經(jīng)皮膚到達門靜脈右前支,中山大學附屬第三醫(yī)院,方 法,采集骨髓,中山大學附屬第三醫(yī)院,方 法

55、,分離MSCs（密度梯度離心法）： 得到單個核細胞，其中MSCs數(shù)量： 單個核細胞數(shù)量 × 10-3～ 10-4 個。,中山大學附屬第三醫(yī)院,方 法,介入途徑回輸,中山大學附屬第三醫(yī)院,方 法,B超途徑回輸,中山大學附屬第三醫(yī)院,對照研究,移植組32例，男30例，女2例，43.8±11.3歲。 對照組60例，男56例，女4例，44.2±11.3歲。篩選標準：1、重型肝炎患者，診斷依

56、照：《2000年病毒性肝炎防治方案 》。2、無其他肝臟疾病及慢性疾病或臟器功能障礙。3、無嚴重并發(fā)癥如嚴重感染、肝昏迷、肝腎綜合征等。4、半年內(nèi)未進行抗病毒治療和免疫調(diào)節(jié)治療。5、所有患者入院后均同時應用相同內(nèi)科綜合治療一周：護肝治療及新鮮血漿、白蛋白等對癥支持處理。6、均未行人工肝或肝移植治療。7、以MSCs自體移植術施行時間為觀察起點。,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,手術成功率100％。所有患者術中未出現(xiàn)嚴重不良反應及并

57、發(fā)癥。術后出現(xiàn)穿刺部位局部血腫、瘀斑4例，骨穿部位與介入穿刺部位各2例，經(jīng)對癥治療后均滿意恢復。術后未出現(xiàn)大量出血、感染、肝區(qū)疼痛不適等并發(fā)癥。,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,術后一到四周肝功能和凝血功能的平均改善情況：移植組均優(yōu)于對照組。1、ALT改善情況：未見顯著差異。2、TBIL改善情況：術后三周起出現(xiàn)顯著差異。3、ALB改善情況：術后四周起出現(xiàn)顯著差異 。 4、PTA改善情況：術后兩周

58、起出現(xiàn)顯著差異。,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,術后一到四周肝功能和凝血功能改善患者的比例對照：移植組均優(yōu)于對照組。 （其中由于慢性肝衰竭患者中ALT正常者較多，故選用ALT上升作為評價肝臟酶學改變的指標）,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,術后一到四周ALT上升患者比例對照,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,術后一到四周TBIL下降患者比例對照,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,術后一到四周ALB上升患者比例對

59、照,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,術后一到四周PTA上升患者比例對照,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,自覺癥狀改善情況（移植組優(yōu)于對照組）,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,（P=0.397）,出院時轉(zhuǎn)歸（移植組優(yōu)于對照組）,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,遠期預后的比較（移植組優(yōu)于對照組）,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 果,在肝功能、凝血功能指標的改善方面，移植組的恢復均較對照組為好，但未見全部具有統(tǒng)計學意義的差異。在自覺癥狀改善和出院轉(zhuǎn)歸以及

60、遠期預后等方面，移植組亦均優(yōu)于對照組，但未見顯著差異。,中山大學附屬第三醫(yī)院,結(jié) 論,部分患者的MSCs自體移植療效欠佳：MSCs細胞數(shù)量較少病情嚴重導致肝內(nèi)框架破壞嚴重而損傷其分化微環(huán)境，導致移植的MSCs定植、分化障礙。,中山大學附屬第三醫(yī)院,目前存在問題,1. 體外標記、體內(nèi)示蹤。2. 具體定植與分化過程。3. 重建肝內(nèi)微結(jié)構(gòu)（小葉、膽管）。4. 功能重建程度以及具體療效評價方法。5. 細胞數(shù)量：100 ～120ml骨