胃癌及癌前病變患者幽門螺桿菌的saba基因多態(tài)性的研究

1、<p>　　胃癌及癌前病變患者幽門螺桿菌的sabA基因多態(tài)性的研究</p><p>　　任 莉，廖亞玲，郭 剛，鄒全明（400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床免疫學(xué)與微生物學(xué)教研室）</p><p>　　[摘要] 目的 對癌癥和癌前病變患者幽門螺桿菌進(jìn)行sabA基因遺傳信息多態(tài)性的研究。方法 采用特異引物聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)及測序和比較基因組方法分析42株國內(nèi)癌癥及

2、癌前病變患者的幽門螺桿菌的sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)多態(tài)性。結(jié)果 sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的陽性檢測率為85%，功能性sabA基因占所有測序菌株的55%。對隨機(jī)挑選的18株檢測陽性的菌株進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示在堿基水平及氨基酸水平存在顯著的遺傳多態(tài)性。對sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的氨基酸序列聚類分析中發(fā)現(xiàn),本研究菌株與國際已經(jīng)完成測序的7株幽門螺桿菌可以明顯的分為兩個組，即中國組與西方組。結(jié)論： sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)在中

3、國菌株中普遍存在，且在翻譯水平有很顯著的多態(tài)性。聚類分析發(fā)現(xiàn)含有功能性sabA基因的幽門螺桿菌菌株多態(tài)性存在明顯的地域性分布差異。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 幽門螺桿菌； sabA基因； CT重復(fù)片段；地域性分布</p><p>　　[中圖法分類號] [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A</p><p>　　Helicobacte

4、r pylori sabA gene polymorphism in patients with gastric cancer and precancerous lesions</p><p>　　Ren Li, Liao Yaling, Guo Gang, Zou Quanming（ (Department of Clinical Microbiology and Immunology, FacultyColl

5、ege of Laboratory Medicine & College of Pharmacy, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China）</p><p>　　[ Abstract ] 　Objective: To identifyApproach to the sialic acid binding adhesin (sa

6、bA) gene polymorphism of Helicobacter pylori stains fromin patients with gastric cancer or precancerous lesions. Methods: The sabA gene CT repeats regulatory domain polymorphism of 42 pylori strains sampled from domestic

7、 24 patients with gastric cancer and 18 with precancerous lesions (intestinal metaplasia) were analyzed by PCR-SSP, sequencing and comparative genomes. Results: Positive detection rate were 85%, an</p><p>　　

8、[ Key words ] Helicobacter pylori; sabA gene; CT repeats; geographical regional distribution</p><p>　　Supported by the National Basic Research Program (973 Program, 2009CB522606). Corresponding author: Zou Q

9、uanming, Tel: 86-23-68752316, E-mail address: qmzou2007@163.com</p><p>　　[基金項(xiàng)目]國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃, 2009CB522606）</p><p>　　[通信作者]鄒全明，電話：(023)68752316，E-mail：qmzou2007@163.com</p><p>

10、　　幽門螺桿菌是定植在胃黏膜的一種革蘭陰性螺旋桿菌，被認(rèn)為是造成慢性胃炎，、胃潰瘍，甚至胃癌的致病因素，而且是胃黏膜淋巴相關(guān)性淋巴瘤的主要危險因素[1]。幽門螺桿菌在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家的感染率和致病率有著很大的差別[2]，而幽門螺桿菌各種毒力因子與宿主的免疫反應(yīng)和宿主遺傳多態(tài)性之間的密切關(guān)系可能與此有關(guān)。</p><p>　　sabA（sialic acid binding adhesin）基因是幽門螺桿菌外膜

11、蛋白家族中非常重要的一類編碼粘附素的基因。其編碼的唾液酸結(jié)合黏附素，能特異性識別人類宿主細(xì)胞上的sialyl-Lewis x/a 抗原 (sLex and sLea)。在正常的胃黏膜中所能檢測到的存在的數(shù)量非常少，隨著幽門螺桿菌菌株的長期定植和持續(xù)性感染，這類抗原會持續(xù)性增多[3]，特別是sLea的表達(dá)量在癌癥患者中顯示有明顯的提高[4]。這也提示sabA基因及其編碼的蛋白可能在幽門螺桿菌感染的后期，甚至在致癌過程中發(fā)揮著重要的作用。&

12、lt;/p><p>　　sabA基因是通過5’端上游的CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)經(jīng)移碼突變所造成的相變異（phase variation），即基因的功能性與非功能性（on/off）來調(diào)節(jié)其編碼蛋白的表達(dá)狀態(tài)。Yamaoka等[5]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，功能性sabA基因可能與腸化生、萎縮性胃炎及胃癌具有相關(guān)性[5]。鑒于sabA基因的功能性表達(dá)存在多態(tài)性，在幽門螺桿菌的致病作用中非常重要，文獻(xiàn)對于sabA基因的研究也越來越

13、多，但是對于中國地區(qū)幽門螺桿菌菌株的sabA基因還缺乏相應(yīng)的研究。因此，本研究擬收集癌癥和癌前病變患者的幽門螺桿菌菌株，進(jìn)行sabA基因多態(tài)性的研究，為sabA基因在幽門螺桿菌致病機(jī)制，尤其是致癌過程中的作用研究提供一些新的線索。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 幽門螺桿菌的臨床采集株</p><p&

14、gt;　　本研究室在2008－2010年期間保存的臨床采集株42株，其中胃癌株24株，腸化生18株。按地區(qū)分：重慶地區(qū)30株，杭州地區(qū)10株，西藏、內(nèi)蒙古各1株。標(biāo)準(zhǔn)株26695作為陽性對照，編號為1。</p><p>　　1.2 幽門螺桿菌的復(fù)蘇，、培養(yǎng)與鑒定</p><p>　　將凍存的幽門螺桿菌菌株復(fù)蘇后,接種于含5%脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上，于5% O2、10% CO2 、

15、85% N2的微需氧條件下培養(yǎng)48～72 h，經(jīng)尿素酶、氧化酶、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)及組織染色等證實(shí)為幽門螺桿菌。</p><p>　　1.3 幽門螺桿菌基因組的提取</p><p>　　采用細(xì)菌基因組提取試劑盒 (上海天根公司) 提取幽門螺桿菌基因組DNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。</p><p>　　1.4 PCR擴(kuò)增sabA基因的調(diào)節(jié)區(qū)片段</p>&

16、lt;p>　　擴(kuò)增sabA基因的調(diào)節(jié)區(qū)片段（即包含CT重復(fù)區(qū)域的片段）所用的引物序列為：正義鏈, 5′GTGGATCCCTTTAAGGAACATTTTATGAAAA-3′；反義鏈, 5′GGAATTCGGTTAGGATAAAAGCGCAAAGATTGT-3′[6]，所有引物均由上海英駿公司合成。PCR擴(kuò)增體系為25μl,其中酶混合物（上海天根公司，2×Taq Plus MasterMix）12.5μl，模板4μl，引物1

17、μl，ddH2O 7.5μl。引物循環(huán)參數(shù):預(yù)變性94℃ 5 min后, 94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 45 s,30個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。4 ℃保存?zhèn)溆?。取PCR產(chǎn)物2μl在2%瓊脂糖凝膠中(含0.5 g/L 溴化乙錠)電泳,以100 bp（上海天根公司）為Marker, 凝膠分析儀成像。</p><p>　　1.5 PCR產(chǎn)物的純化、測序與序列分析</p><

18、;p>　　所有陽性的PCR擴(kuò)增條帶均由試劑盒（上海英駿公司）回收純化。純化后產(chǎn)物送由Takara公司進(jìn)行測序。序列分析由DNAssist 2.0完成。按照隨機(jī)選取的原則，根據(jù)胃黏膜標(biāo)本收取的時間按疾病分別編號（即分層抽樣），各自選取疾病單數(shù)號的純化條帶標(biāo)本送公司測序（即系統(tǒng)抽樣）。</p><p><b>　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</b></p><p>　　采用

19、SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件的fisher精確檢驗(yàn)方法對陽性率與疾病的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用MEGA 5.0聚類軟件的construct UPGMA tree 功能聚類。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)的檢測</p><p>　　42名中國癌癥及腸化生患者的幽門螺桿

20、菌基因組中，有36株菌中檢測到包含sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的片段（約600 bp），見圖1，其陽性率為85.7%。其中，胃癌的陽性率為83.3%（20/24），腸化生的陽性率為88.9%(16/18)。陽性率與疾病沒有明顯相關(guān)性（P > 0.05）。</p><p>　　ORF讀碼框序列來自菌株26695的sabA基因，GenBank編號為HP0725</p><p>　　圖1 sabA基

21、因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)示意圖</p><p>　　圖2 sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)（600 bp）的PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖</p><p>　　2.2 sabA基因CT雙核苷酸重復(fù)序列分析</p><p>　　對36名sabA陽性患者根據(jù)分層抽樣和系統(tǒng)抽樣的原則選取18株菌株進(jìn)行測序，其中胃癌10株，腸化生8株。測序結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)顯示，核苷酸序列的點(diǎn)

22、突變、丟失及替換非常普遍。所有菌株均含有CT雙核苷酸重復(fù)序列，其中常規(guī)CT雙核苷酸重復(fù)序列有7株，而非常規(guī)CT雙核苷酸重復(fù)序列（CTTTCTCT）有11株。不同的CT重復(fù)序列導(dǎo)致不同的氨基酸表達(dá)狀態(tài)（表1）。其中有5株菌株由于常規(guī)CT雙核苷酸重復(fù)序列讀碼框移而成為非功能性。然而，CT重復(fù)片段的框移與sabA基因的功能性并不是完全相匹配的，CT重復(fù)序列也需伴隨一定的堿基丟失或插入才能實(shí)現(xiàn)翻譯水平的調(diào)控。而非常規(guī)CT雙核苷酸重復(fù)序列均具有功

23、能性?？偟膩碚f，功能性sabA基因占所有測序菌株的72.2%。其中，胃癌的功能性基因的比率為占80%(8/10)，腸化生的功能性基因的比率為占62.5%(5/8)。功能性基因的比率與疾病沒有明顯相關(guān)性（P > 0. 05）。</p><p>　　表1 常規(guī)CT雙核苷酸重復(fù)序列表達(dá)情況</p><p>　　下劃線表示堿基水平因移碼突變產(chǎn)生終止密碼子；a: 表示翻譯水平因終止密碼子的出現(xiàn)

24、而停止</p><p>　　…1 ：此處省略12個堿基，…2：此處省略21個堿基，…3：此處省略13個堿基，…4：此處省略17個堿基</p><p>　　2.3 功能性sabA基因氨基酸水平序列同源性的比較</p><p>　　在氨基酸序列方面，非常規(guī)CT雙核苷酸重復(fù)序列（CTTTCTCT）的11株菌株，雖然缺乏CT重復(fù)序列的調(diào)節(jié)作用，然而由于堿基的突變導(dǎo)致氨基酸水

25、平也出現(xiàn)了較大的多態(tài)性。圖23顯示了12株（11株非常規(guī)+1株常規(guī)）功能性基因與7株NCBI數(shù)據(jù)庫中已全基因組測序菌株的樹狀聚類圖。由圖3可以看到，可見中國的菌株與這7株幽門螺桿菌可以明顯的分為兩個組，即中國組與西方組。與西方國家的菌株相比，中國的菌株相互之間同源性更明顯。</p><p>　　國外菌株來源地：CUZ20(美國)，V225D（美印第安人），SAT464(秘魯),26695(美國)，J99(美國)，

26、B128（美國），HPAG1(美國)</p><p>　　圖3 12株中國菌株與7株已全基因組測序菌株的sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)氨基酸序列同源性比較的聚類圖</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　在幽門螺桿菌的致病機(jī)制研究中，對相關(guān)毒力因子的研究十分重要。前期研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌的黏附素，可以特異性的結(jié)合宿主細(xì)胞相應(yīng)的大分

27、子受體，這類蛋白的編碼基因包括oipA，babA，sabA等。然而，在長期的定植過程中，宿主持續(xù)的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致與babA發(fā)生特異性結(jié)合的Lewis抗原，逐漸被與sabA特異性結(jié)合的sialyl-Lewis x/a抗原所取代[3; 7]。同時有研究[4]表明，這種sialyl-Lewis x/a抗原在健康的胃黏膜上非常少，而在胃癌患者的胃黏膜上，其表達(dá)量顯著增加。因此可以推斷，sabA基因可能在幽門螺桿菌致病的中后期，甚至是致癌機(jī)制中發(fā)

28、揮了重要的作用，特別是功能性的sabA可能與嚴(yán)重的腸化生和萎縮性胃炎，以及胃癌有明顯的關(guān)系[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了42名國內(nèi)來源的癌前病變及胃癌患者，對其感染的幽門螺桿菌sabA基因進(jìn)行多態(tài)性研究。目前對于中國國內(nèi)幽門螺桿菌菌株sabA基因多態(tài)性的研究還未見報(bào)道。</p><p>　　研究[5; 8]證實(shí)幽門螺桿菌的sabA基因都存在功能性（on）和非功能性（off）兩種表達(dá)狀態(tài)。而5’端上游的CT雙核苷酸重復(fù)

29、序列調(diào)節(jié)區(qū)在SabA蛋白表達(dá)上發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)特異性的針對sabA基因的CT重復(fù)序列片段（約600 bp）進(jìn)行比較基因組分析。盡管還沒有研究對不同菌株克隆之間的CT重復(fù)片段差異進(jìn)行研究，卻有研究者發(fā)現(xiàn)sabA在不同菌株克隆的表達(dá)狀態(tài)存在差異[5]。然而，該研究同時也證明，在原代培養(yǎng)中挑取的單個菌落的表達(dá)狀態(tài)通常代表了占優(yōu)勢的菌株克隆的表達(dá)狀態(tài)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在原代培養(yǎng)中挑取單個菌落并傳代培養(yǎng)后提取基因組作為測序?qū)ο蟆Ｔ谀壳?/p>

30、的研究中，對于功能性sabA基因尚無統(tǒng)一的定義。傳統(tǒng)的方法認(rèn)為，7 ± 3 CT 重復(fù)片段可以認(rèn)為是有功能的基因。然而，近期研究表明，sabA的表達(dá)還受到其他因素的調(diào)節(jié)，可能并不完全依賴于CT重復(fù)序列[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)中將具有完整的氨基酸翻譯功能定義為基因有潛在的功能性[10]。結(jié)果表明，CT重復(fù)序列的調(diào)節(jié)也需伴隨一定區(qū)域的堿基丟失和插入才能實(shí)現(xiàn)翻譯水平的調(diào)控（表1）。常規(guī)的CT重復(fù)片段在18株sabA基因陽性菌株中所占的比

31、率</p><p>　　42例中國癌前病變及癌癥來源菌株的sabA功能性基因占55%，而哥倫比亞的癌癥患者來源菌株sabA功能性基因占70%[5]。另外，日本和美國的胃疾病患者來源菌株sabA功能性基因分別為81%和56%[5; 6]。中國菌株sabA功能性基因的多態(tài)性結(jié)果與其他國家存在差異，提示sabA基因的多態(tài)性可能存在地域差異[12]。對中國菌株與國外已全基因組測序的7株進(jìn)行聚類分析后發(fā)現(xiàn)，中國的菌株與國外

32、的菌株可以明顯的分為兩個組，這個結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。從疾病的角度來說，功能性sabA基因在嚴(yán)重的胃部疾?。ɡ缥赴┘鞍┣安∽儯┲兴急壤蟠蟪^在非嚴(yán)重胃部疾?。ㄈ缏晕秆祝┲械谋壤齕6]。因此可以將sabA基因作為幽門螺桿菌基因分型的一個標(biāo)志，結(jié)合vacA, cagA的結(jié)果綜合分析菌株來源及致病性。然而，對中國菌株sabA基因與疾病的相關(guān)性分析還需進(jìn)一步的流行病學(xué)分析。</p><p><b>　　參考

33、文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Uemura N, Okamoto S, Yamamoto S, et al. Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer[J]. N Engl J Med, 2001, 345(11):784- 789.</p><p>　　[2] Grah

34、am D Y, Lu H, Yamaoka Y. African, Asian or Indian enigma, the East Asian Helicobacter pylori: facts or medical myths [J]. J Dig Dis, 2009, 10(2): 77-84.</p><p>　　[3] Mahdavi J, Sonden B, Hurtig M, et al. Hel

35、icobacter pylori SabA adhesin in persistent infection and chronic inflammation [J]. Science, 2002, 297(5581): 573-578.</p><p>　　[4] Sakamoto S, Watanabe T, Tokumaru T, et al. Expression of Lewisa, Lewisb, Le

36、wisx, Lewisy, siayl-Lewisa, and sialyl-Lewisx blood group antigens in human gastric carcinoma and in normal gastric tissue [J]. Cancer Res, 1989, 49(3):745-752.</p><p>　　[5] Yamaoka Y, Ojo O, Fujimoto S, et

37、 al. Helicobacter pylori outer membrane proteins and gastroduodenal disease [J]. Gut, 2006, 55(6):775-781.</p><p>　　[6] Yanai A, Maeda S, Hikiba Y, et al. Clinical relevance of Helicobacter pylori sabA genot

38、ype in Japanese clinical isolates[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2007, 22(12):2228-2232.</p><p>　　[7] Ota H, Nakayama J, Momose M, et al. Helicobacter pylori infection produces reversible glycosylation changes

39、 to gastric mucins [J]. Virchows Arch, 1998, 433(5):419-426.</p><p>　　[8] Yamaoka Y, Kita M, Kodama T, et al. Helicobacter pylori infection in mice: Role of outer membrane proteins in colonization and inflam

40、mation [J]. Gastroenterology, 2002, 123(6):1992-2004.</p><p>　　[9] Yamaoka Y. Increasing evidence of the role of Helicobacter pylori SabA in the pathogenesis of gastroduodenal disease [J]. J Infect Dev Ctrie

41、s, 2008, 2(3): 174-181.</p><p>　　[10] Chiarini A, Cala C, Bonura C, et al. Prevalence of virulence-associated genotypes of Helicobacter pylori and correlation with severity of gastric pathology in patients f

42、rom western Sicily, Italy [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 28(5):437-446.</p><p>　　[11] Sheu B S, Odenbreit S, Hung K H, et al. Interaction between host gastric Sialyl-Lewis X and H. pylori SabA e

43、nhances H. pylori density in patients lacking gastric Lewis B antigen[J]. Am J Gastroenterol, 2006, 101(1):36-44.</p><p>　　[12] Shao L, Takeda H, Fukui T, et al. Genetic diversity of the Helicobacter pylori