肺癌細(xì)胞中sox1調(diào)控ect2的表達(dá)

1、<p>　　肺癌細(xì)胞中SOX1調(diào)控ECT2的表達(dá)</p><p>　　李寧1 李曉冰2 李素云1</p><p>　?。?河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，鄭州，450008；</p><p>　　2河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州，450008）</p><p>　　[摘要] 目的 探討肺癌細(xì)胞中SOX1基因是否直接調(diào)控ECT

2、2的表達(dá)。方法 以肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞為研究對(duì)象，Realtime-PCR檢測(cè)ECT2表達(dá)情況。通過(guò)熒光素酶報(bào)告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法檢測(cè)SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)60例肺癌組織中ECT2與SOX1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果 過(guò)表達(dá)SOX1后A549細(xì)胞中ECT2表達(dá)下降，而siRNA抑制SOX1后ECT2表達(dá)升高，熒光素酶報(bào)告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法提示SOX1可直接與ECT2啟動(dòng)子結(jié)合，抑制ECT2的

3、表達(dá)。SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.433，P =0.001)。結(jié)論 肺癌細(xì)胞A549中SOX1基因直接調(diào)控ECT2的表達(dá)。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 肺癌；SOX1；ECT2</p><p>　　SOX1 is a novel transcriptional repressor for ECT2 in human lung cancer</p>

4、<p>　　Li Ning1 Li Xiao-bing2 Li Su-yun1 </p><p>　　1 The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine;2 Basic Medical College of Henan University of Traditional Chi

5、nese Medicine, China</p><p>　　ABSTRACT Objective To test whether SOX1 is a novel transcriptional repressor for ECT2 in human lung cancer. Methods The expression of ECT2 in the A549 cell was detected by Re

6、altime-PCR. We determined whether SOX1 may regulate the expression of ECT2 by using Chromin immunoprecipitation (ChIP) assay and Luciferase activity assay. Immunohistochemical analysis was used to test whether there is a

7、n inverse correlation between ECT2 and SOX1. Results Ectopic expression of SOX1 in the A549 cell repre</p><p>　　[KEY WORDS] Lung cancer; SOX1; ECT2</p><p>　　肺癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命和健康的惡性腫瘤之一，也是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡率最

8、高的癌癥。以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案是目前針對(duì)NSCLC主要的治療方法，然而，肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生的耐藥是困擾臨床的難題[1]。SOX1，即SRY (sex determining region Y)-box 1，屬于具有high mobility group (HMG)-box結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族SOX家族的成員。我們前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX1基因在A549細(xì)胞中處于非甲基化狀態(tài)，在耐順鉑細(xì)胞株A549/cis細(xì)胞中處于高甲基化狀態(tài)。抑制SOX1表

9、達(dá)可通過(guò)激活肺癌細(xì)胞自噬能力，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞耐藥[2]。前期實(shí)驗(yàn)我們通過(guò)cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SOX1后ECT2基因表達(dá)降低，本研究我們將探討肺癌細(xì)胞中SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2的表達(dá)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料與試劑</b></p><p&g

10、t;　　人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；SOX1表達(dá)質(zhì)粒p-CMV-SOX1及SOX1 siRNA購(gòu)自吉?jiǎng)P生物，ChIP試劑盒購(gòu)自Upstate Biotechnology公司，Dual-Luciferase檢測(cè)試劑盒及Transfect脂質(zhì)體購(gòu)自Qiagen公司。其他如RT 及PCR 相關(guān)試劑、DNA Marker、Trizol( TaKaRa 公司)。</p><p>　　1.2 Realtime-

11、PCR檢測(cè)ECT2表達(dá)情況</p><p>　　培養(yǎng)A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1或SOX1 siRNA，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Realtime -PCR檢測(cè)ECT2表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行結(jié)果校正。引物序列參見(jiàn)表1。</p><p>　　1.3 染色體免疫共沉淀</p><p>　　培養(yǎng)A54

12、9細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1，按照ChIP試劑盒抽提DNA，所需抗體分別加入SOX1抗體及IgG抗體為陰性對(duì)照，收集DNA。未加抗體組設(shè)為Input。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查出ECT2基因5’端-1000bp至+100bp序列（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為0），設(shè)計(jì)5對(duì)引物(圖. 2A)，用上述5對(duì)引物通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)每個(gè)樣本Ct值，靶序列的Ct值=2(Ct of Ip’ed DNA-Ct of input) 。</p

13、><p>　　1.4 熒光素酶報(bào)告法</p><p>　　根據(jù)ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段為，包含SOX1結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并連接至pGL3熒光質(zhì)粒，構(gòu)建pGL3-ECT質(zhì)粒，培養(yǎng)A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1和pGL3-ECT質(zhì)?；騪-CMV-vector和pGL3-ECT質(zhì)粒，同時(shí)均轉(zhuǎn)染phRL-TK renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參，通過(guò)Dual-Lucif

14、erase檢測(cè)試劑盒測(cè)熒光值。</p><p>　　1.5 免疫組化檢測(cè)肺癌組織中SOX1及ECT2表達(dá)情況</p><p>　　60例肺癌組織切片通過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)程序后分別加入SOX1抗體及ECT2抗體，通過(guò)免疫組織試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。免疫組化評(píng)分按照染色強(qiáng)度分為：0,1,2,3分，而染色面積則按<5% (0分)， 5-25% (1分)， 25-50% (2分)， >

15、50% (3分)。染色強(qiáng)度及染色面積結(jié)合算分，總分0-1分為陰性，>1分為陽(yáng)性[3]。</p><p>　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p&g

16、t;<p>　　2.1 SOX1調(diào)控ECT2的表達(dá)</p><p>　　培養(yǎng)A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1或SOX1 siRNA，Realtime -PCR檢測(cè)ECT2表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒后，ECT2 mRNA值降低（P <0.05），而轉(zhuǎn)染SOX1 siRNA后，ECT2 mRNA值升高（P <0.05）。見(jiàn)圖1。</p>&

17、lt;p>　　2.2 染色體免疫共沉淀與熒光素酶報(bào)告法</p><p>　　培養(yǎng)A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1，按照ChIP試劑盒抽提DNA，所需抗體分別加入SOX1抗體及IgG抗體為陰性對(duì)照，收集DNA。Realtime-PCR檢測(cè)每個(gè)樣本Ct值，靶序列的Ct值=2(Ct of Ip’ed DNA-Ct of input)。我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)其他引物，A4靶序列的Ct值較高 （P <

18、0.05），證明SOX1抗體與該段DNA序列可能結(jié)合（圖2B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)引物擴(kuò)增A4片段，連接入pGL3熒光質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1和pGL3-ECT質(zhì)?；騪-CMV-vector和pGL3-ECT質(zhì)粒，同時(shí)均轉(zhuǎn)染phRL-TK renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參，檢測(cè)pGL3-ECT質(zhì)粒熒光值變化。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒的細(xì)胞pGL3-ECT熒光值明顯較轉(zhuǎn)染p-CMV-vector質(zhì)粒的細(xì)胞低（P

19、<0.05）。見(jiàn)圖3。</p><p>　　2.3 SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)</p><p>　　20例肺癌組織表達(dá)SOX1，這20例肺癌組織中有14例ECT2的表達(dá)陰性。36例肺癌組織表達(dá)ECT2，這些組織中30例SOX1表達(dá)陰性(表2)。結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.433，P =0.001)。圖4顯示的兩例肺癌組織SOX1與ECT

20、2的表達(dá)情況。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　SOX1，即SRY (sex determining region Y)-box 1，屬于具有high mobility group (HMG)-box結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族SOX家族的成員，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[4]。家族中其他成員如SOX9，SOX17可以通過(guò)直接與β-caten

21、in結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin降解或直接抑制其功能（β-catenin是參與經(jīng)典Wnt通路的重要因子），從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[5,6]。在肝癌和宮頸癌細(xì)胞中，SOX1發(fā)揮抑癌基因作用，抑制細(xì)胞的增長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力[7]。我們以肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株為研究對(duì)象，通過(guò)低劑量順鉑長(zhǎng)時(shí)間處理A549，建立了A549/cis耐順鉑細(xì)胞株，通過(guò)MSP、BSP甲基化檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)SOX1基因在A549細(xì)胞中處于非甲基化狀態(tài)，而在A54

22、9/cis細(xì)胞中處于高甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑制SOX1表達(dá)可激活肺癌細(xì)胞自噬能力，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞耐藥[2]。</p><p>　　我們通過(guò)基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SOX1后，A549細(xì)胞有130個(gè)基因下調(diào)，其中包括ECT2。Epithelial cell transforming sequence 2 (ECT2) 是鳥(niǎo)苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange facto

23、rs，GEFs)之一，GEF促進(jìn)RhoA，Racl和Cdc42上的GDP置換為GTP，使RhoA，Racl和Cdc42等Rho GTPases活化[8,9]。目前尚未有關(guān)SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2表達(dá)的報(bào)道。</p><p>　　我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SOX1后A549細(xì)胞中ECT2表達(dá)下降，而抑制SOX1后ECT2表達(dá)升高，熒光素酶報(bào)告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法提示SOX1可直接與ECT2啟動(dòng)子結(jié)合，抑制EC

24、T2的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)。</p><p>　　ECT2在肺癌組織中高表達(dá)，并且在轉(zhuǎn)移癌組織中表達(dá)更高，與肺癌細(xì)胞的分化以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。而SOX1基因在肺癌組織中低表達(dá)，啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致其低表達(dá)的重要原因之一。我們推測(cè)可能因SOX1低表達(dá)，失去對(duì)ECT2的抑制，導(dǎo)致ECT2在肺癌組織中高表達(dá)。鑒于SOX1與ECT2均與肺癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，我們下步

25、將進(jìn)一步深入探討SOX1是否通過(guò)抑制ECT2功能參與調(diào)控肺癌細(xì)胞遷移能力。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn):</b></p><p>　　[1]Li N, Zhang F, Li S, Zhou S. Epigenetic silencing of MicroRNA-503 regulates FANCA expression in non-small cel

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37、 adenocarcinoma. Cancer science. 2014 Jan 31.</p><p>　　圖1：過(guò)表達(dá)SOX1后A549細(xì)胞中ECT2表達(dá)下降，而siRNA抑制SOX1后ECT2表達(dá)升高。</p><p>　　圖2：A， 5對(duì)引物所擴(kuò)增的DNA片段位置。B，A4靶序列的Ct值較高 （P <0.05），說(shuō)明SOX1抗體與該段DNA序列可能結(jié)合。</p>

38、<p>　　圖3：轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒的細(xì)胞pGL3-ECT熒光值明顯較轉(zhuǎn)染p-CMV-vector質(zhì)粒的細(xì)胞低。熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證SOX1與A4靶序列結(jié)合，調(diào)控ECT2的表達(dá)。</p><p>　　圖4：免疫組化檢測(cè)肺癌組織SOX1與ECT2的表達(dá)（×200）。結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)。</p><p>　　通訊作者：李素云 E-m