乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)研究【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學(xué)與工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b></p

3、><p><b>　　中文摘要：0</b></p><p><b>　　英文摘要：0</b></p><p><b>　　0前言1</b></p><p><b>　　1材料1</b></p><p><b>　　1.

4、1菌種1</b></p><p><b>　　1.2培養(yǎng)基1</b></p><p>　　1.2.1培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基）1</p><p>　　1.2.2計數(shù)培養(yǎng)基（MRS固體培養(yǎng)基）1</p><p>　　1.3主要儀器設(shè)備1</p><p><b>　　1

5、.4主要試劑1</b></p><p><b>　　2 實驗方法2</b></p><p>　　2.1 菌種活化2</p><p>　　2.2 pH值的測定2</p><p>　　2.3 吸光值的測定2</p><p>　　2.4 活菌計數(shù)2</p><

6、p>　　2.5 補料分批培養(yǎng)2</p><p>　　2.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化2</p><p>　　2.6.1 接種量2</p><p>　　2.6.2 pH值2</p><p>　　2.6.3 溶氧量2</p><p>　　2.6.4 培養(yǎng)時間2</p><p>　　2.7 培

7、養(yǎng)基成分的優(yōu)化2</p><p>　　2.7.1 不同碳源對乳酸菌培養(yǎng)的影響2</p><p>　　2.7.2 不同氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響3</p><p>　　2.7.3不同緩沖鹽對乳酸菌培養(yǎng)的影響3</p><p>　　2.7.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長因子的添加3</p><p>　　2.8 正交試驗3&l

8、t;/p><p>　　2.9 補料分批培養(yǎng)3</p><p>　　2.9.1 補料因素的選擇3</p><p>　　2.9.1.1 補料碳源對乳酸菌培養(yǎng)的影響3</p><p>　　2.9.1.2 補料氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響4</p><p>　　2.9.1.3 補料一定比例的碳源和氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響4<

9、;/p><p>　　2.9.2 補料量的優(yōu)化4</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論4</b></p><p>　　3.1培養(yǎng)條件的單因素試驗4</p><p>　　3.1.1 接種量4</p><p>　　3.1.2 pH值4</p><p>　　3.1.3

10、溶氧量5</p><p>　　3.1.4 培養(yǎng)時間5</p><p>　　3.2 培養(yǎng)基成分的單因素實驗6</p><p>　　3.2.1 碳源6</p><p>　　3.2.2 氮源6</p><p>　　3.2.3 緩沖鹽6</p><p>　　3.2.4 生長因子7</

11、p><p>　　3.3 正交試驗7</p><p>　　3.3.1正交分析7</p><p>　　3.3.2 極差趨勢圖分析8</p><p>　　3.3.3 方差分析8</p><p>　　3.4 補料分批培養(yǎng)9</p><p>　　3.4.1 補料因素選擇9</p>&

12、lt;p>　　3.4.1.1 補料碳源對乳酸菌培養(yǎng)的影響9</p><p>　　3.4.1.2 補料氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響9</p><p>　　3.4.1.3 補料一定比例的碳源和氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響9</p><p>　　3.4.2 補料量的優(yōu)化10</p><p><b>　　4 結(jié)論11</b>

13、</p><p><b>　　中文摘要：</b></p><p>　　摘要：本研究以MRS培養(yǎng)基為細菌增殖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在優(yōu)化培養(yǎng)條件 (接種量、起始pH值、溶氧量、培養(yǎng)時間)和培養(yǎng)基成分(碳源、氮源、緩沖鹽及生長因子)的基礎(chǔ)上，采用補料分批培養(yǎng)法進行乳酸菌的高密度培養(yǎng)。實驗得出的最佳培養(yǎng)條件是：接種量為3%，pH值6.5左右，培養(yǎng)時間為20h，生長因子為VB5 和谷酰

14、胺酸，正交試驗得出氮源蛋白胨1.5%，碳源葡萄糖2%，緩沖鹽磷酸氫二鉀1%為最優(yōu)條件。在此基礎(chǔ)上，通過補料分批培養(yǎng)方式進行高密度培養(yǎng)，得到的優(yōu)化補料策略為：高密度培養(yǎng)時補料碳氮源比單獨補料碳源或者碳源要好，而且分批補料一定比例碳氮源（2:1.5）的補料總量的最佳值為7.5%，即初始補料2.5%，4h和8h后各補料2.5%，得到的活菌數(shù)最高，比常規(guī)培養(yǎng)高了5倍，為進一步制備乳酸菌發(fā)酵劑奠定了基礎(chǔ)。</p><p>

15、　　關(guān)鍵詞： 乳酸菌；高密度；培養(yǎng)條件優(yōu)化；培養(yǎng)基成分優(yōu)化；補料分批培養(yǎng)。</p><p><b>　　英文摘要：</b></p><p>　　Abstract: In this study, based on MRS medium for cell culture medium, in the optimal culture conditions (inoculum

16、 size, pH, dissolved oxygen, culture time, etc.) and medium composition (Carbon, nitrogen, buffer salts and growth factors), based on the use of fed-batch culture method high density culture of lactic acid bacteria, lact

17、ic acid bacteria starter for the further preparation of the basis. The optimum experimental culture conditions were: inoculation of 3%, pH value of about 6.5, incubati</p><p><b>　　字典</b></p>

18、;<p>　　Key words: lactobacillus; high-density; culture condition optimize; Optimization of medium composition;fed-batch culture.</p><p><b>　　0前言</b></p><p>　　乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳制品、泡菜、干酪

19、、發(fā)酵香腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品，并賦予其特殊質(zhì)地、風(fēng)味和口感的重要微生物菌群，而這些傳統(tǒng)食品的專用發(fā)酵劑的生產(chǎn)和研制將對實現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)、縮短產(chǎn)品成熟期、使產(chǎn)品特征標(biāo)準(zhǔn)化和安全化起重要作用，也是傳統(tǒng)食品的發(fā)展方向[1,2]。濃縮發(fā)酵劑[1,2,4]具有活力高、體積小、攜帶使用方便的特點，可直接用于發(fā)酵制品生產(chǎn)，省去擴大培養(yǎng)的復(fù)雜操作過程，從而簡化產(chǎn)品生產(chǎn)工藝，有利于保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，防止菌種的退化和污染。乳酸菌濃縮發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵是要實現(xiàn)其

20、高活性、高密度的培養(yǎng)[2,4]。高密度培養(yǎng)技術(shù)一般指在液體培養(yǎng)中的細胞密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)，達到提高菌體發(fā)酵密度的目的[5]。高密度培養(yǎng)不僅可減少培養(yǎng)體積，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高產(chǎn)品市場競爭力[4]。因此，研究探索乳酸菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)具有重要意義。</p><p>　　在培養(yǎng)過程中，緩沖鹽法和化學(xué)中和法應(yīng)用較多，但菌數(shù)較低。而透析法由于對設(shè)備和技

21、術(shù)要求較高，僅在國外資料中有報道[6]。補料分批培養(yǎng)作為一種高密度培養(yǎng)手段，應(yīng)用于重組大腸桿菌的培養(yǎng)較為普遍，而應(yīng)用于乳酸菌高密度培養(yǎng)鮮有報道[7]。 </p><p>　　一般來說，脫脂乳和乳清是乳酸菌的最佳培養(yǎng)基，但是使用乳清基質(zhì)培養(yǎng)基時，乳清蛋白易發(fā)生熱變性，產(chǎn)生沉淀，同時乳基質(zhì)和乳清基質(zhì)培養(yǎng)基因其增殖慢或不易分離菌體而不易采用，常常要配合其他的生長因子方可使用[7]。</p><p&

22、gt;　　本研究以MRS，在優(yōu)化培養(yǎng)條件 (接種量、起始pH值、溶氧量、培養(yǎng)時間等)和培養(yǎng)基成分(碳源、氮源、緩沖鹽、生長因子)的基礎(chǔ)上，采用補料分批培養(yǎng)法進行乳酸菌的高密度培養(yǎng)，為進一步制備乳酸菌發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　1材料</b></p><p><b>　　1.1菌種</b></p><p>

23、　　戊糖乳桿菌，本實驗室分離和保藏</p><p><b>　　1.2培養(yǎng)基</b></p><p>　　1.2.1培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基） </p><p>　　胰蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 酵母膏 5g</p><p>　　磷酸氫二鉀 2g

24、 檸檬酸二銨 2g 乙酸鈉 5g</p><p>　　葡萄糖 20g 吐 溫80 1mL MgSO４·7H2O 0.58g</p><p>　　MnSO４·H2O 0.189g 加水至1000mL 滅菌20min，T 115℃</p><

25、p>　　1.2.2計數(shù)培養(yǎng)基（MRS固體培養(yǎng)基） </p><p>　　在液體培養(yǎng)基里加瓊脂14g，溶解再滅菌。</p><p><b>　　1.3主要儀器設(shè)備</b></p><p>　　LDAX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 </p><p>　　DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床

26、 上海杜科自動化設(shè)備有限公司</p><p>　　YP-202N 型電子天平 Acculab公司</p><p>　　pH S-25型數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司 </p><p>　　分光光度計

27、 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠</p><p>　　DS-高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠</p><p>　　雙層落地恒溫振蕩器 太倉光明實驗分析儀器廠</p&g

28、t;<p>　　HWS26型電熱恒溫水浴鍋 </p><p><b>　　1.4主要試劑</b></p><p>　　番茄汁，胡蘿卜汁，平菇汁 實驗室自制 </p><p>　　蛋白胨

29、 生化試劑上海東海制藥廠</p><p>　　麥芽糖 生化試劑上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司</p><p>　　瓊脂 BR 中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司</p><p>　　吐溫 80

30、 CR中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司</p><p>　　蛋白胨 生化試劑中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司</p><p>　　牛肉浸膏 生化試劑中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司</p><p>　　磷酸二氫鉀

31、 天津市博迪化工有限公司</p><p>　　葡萄糖 天津市博迪化工有限公司</p><p>　　蔗糖 廣東光華化學(xué)廠有限公司</p><p>　　乳糖

32、 上海試劑二廠</p><p><b>　　2 實驗方法</b></p><p><b>　　2.1 菌種活化</b></p><p>　　無菌條件下將實驗室保藏的菌種少許接入滅菌的MRS培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)24h，即菌液渾濁后連續(xù)培養(yǎng)3代，再可進行接種。</p><p>　　

33、2.2 pH值的測定</p><p>　　采用pH計在室溫下測定培養(yǎng)基的pH值[8]。</p><p>　　2.3 吸光值的測定</p><p>　　借鑒熊濤等[8]的實驗方法，采用UV8500紫外分光光度計在600nm下比色，以蒸餾水為空白,測定菌液吸光值(OD值)。</p><p><b>　　2.4 活菌計數(shù) </b&g

34、t;</p><p>　　取1mL發(fā)酵液加入到9ml滅菌的生理鹽水中，依次做10倍系列稀釋，選取三個適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，吸取1ml稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中，涂布法在計數(shù)培養(yǎng)基上涂布均勻，每個稀釋度做三個平行培養(yǎng)皿[5]。培養(yǎng)基倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。選取菌落數(shù)在30-300之間的培養(yǎng)皿計菌落數(shù)。</p><p>　　2.5 補料分批培養(yǎng)</p><p>　

35、　根據(jù)菌株生長和初始培養(yǎng)基的特點，在分批培養(yǎng)的適當(dāng)階段間歇地補加碳氮源，培養(yǎng)24h后測定OD值。</p><p>　　2.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 </p><p><b>　　2.6.1 接種量</b></p><p>　　根據(jù)葉明等[9]的文獻，在100ml三角瓶中倒入70mlMRS液體培養(yǎng)基，殺菌冷卻后分別按1%、2%、3%、4%、5%的

36、接種量接入菌種，于37℃條件下在搖床中培養(yǎng)24h，取樣分別用平板涂布法測定菌落數(shù)，用分光光度計測定吸光值的方法測定菌密度。</p><p><b>　　2.6.2 pH值</b></p><p>　　借鑒文獻[10]上的方法，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值在7.5、7.0、6.5、6.0四個點上。在100ml三角瓶中分別裝入70ml pH調(diào)至以上4 個值的液體

37、培養(yǎng)基以及作為空白對照的MRS液體培養(yǎng)基，接種后37℃條件下在搖床中培養(yǎng)24h，取樣分別用平板涂布法和測定吸光值的方法測定活菌落數(shù)及菌體密度。</p><p><b>　　2.6.3 溶氧量</b></p><p>　　在100ml三角瓶中分別裝入70 ml的MRS培養(yǎng)基，滅菌接種后分別在0、4 0、8 0 、120、160r/mi n的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h，取樣測

38、定培養(yǎng)液的菌密度，并由此確定最適振蕩頻率。 </p><p>　　2.6.4 培養(yǎng)時間</p><p>　　菌種活化擴培后，按最佳培養(yǎng)方式在適宜條件下培養(yǎng)24h， 1h取樣測定OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制乳酸菌OD值變化曲線。</p><p>　　2.7 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化</p><p>　　2.7.1 不同碳源對

39、乳酸菌培養(yǎng)的影響</p><p>　　在MRS 液體培養(yǎng)基條件下，固定除碳源以外的因素，選擇乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖四種碳源分別加入培養(yǎng)基中，含量都為2%[11]。在100ml三角瓶中分別裝入70ml的MRS液體培養(yǎng)基，接種量3.0%，培養(yǎng)溫度37℃，接種后在搖床中培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)液的菌體密度。分別以1%、2%、3%、4%、5%的含量加入培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，測定菌密度，確定碳源的最佳加入量。</p>

40、;<p>　　2.7.2 不同氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響</p><p>　　在MRS 液體培養(yǎng)基條件下，固定除氮源以外的因素，選擇蛋白胨、硫酸銨、尿素和硝酸鉀四種氮源分別加入培養(yǎng)基中，含量都為1%[11]。在100ml三角瓶中分別裝入70ml的MRS液體培養(yǎng)基，接種量3.0%，培養(yǎng)溫度37℃，接種后在搖床中培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)液的菌密度。確定最佳氮源后，分別以0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的

41、含量加入培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，測定菌密度，確定氮源的最佳加入量。</p><p>　　2.7.3不同緩沖鹽對乳酸菌培養(yǎng)的影響</p><p>　　在MRS液體培養(yǎng)基條件下，選擇磷酸鹽、醋酸鈉、磷酸鹽和醋酸鈉（1:1）、不加磷酸鹽或醋酸鈉四種方式分別加入培養(yǎng)基中，總量都為0.7%[11]。在100ml三角瓶中分別裝入70ml的MRS培養(yǎng)基，接種量3.0%，培養(yǎng)溫度37℃，接種后在搖床中培養(yǎng)24h

42、，測定培養(yǎng)液的菌密度。確定緩沖鹽后，分別以0.4%、0.7%、1.0%、1.5%、2%、3%的含量加入培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，測定菌密度，確定緩沖鹽的加入量。</p><p>　　2.7.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長因子的添加</p><p>　?。?）平菇浸汁的制備</p><p>　　取鮮菇200g，切碎加入適量蒸餾水煮沸5min后，移入組織搗碎機搗碎，抽濾過濾，定容到400

43、ml，即為平菇浸汁，分別以5%、10%、15%、20%、25%的量加入液體培養(yǎng)基中滅菌備用。</p><p>　?。?）胡蘿卜汁的制備</p><p>　　取新鮮胡蘿卜200g洗凈切碎，加入適量蒸餾水煮沸30min后，組織搗碎機搗碎，抽濾過濾，定容到400ml，即為胡蘿卜汁，分別以5%、10%、15%、20%、25%的量加入液體培養(yǎng)基中滅菌備用。</p><p>　

44、?。?）西紅柿汁的制備</p><p>　　將200g西紅柿洗凈，加入適量蒸餾水放于鍋內(nèi)煮沸，抽濾過濾，定容到400ml，即為西紅柿汁，分別以5%、10%、15%、20%、25%的量加入液體培養(yǎng)基中滅菌備用。</p><p><b>　　（4）其他生長因子</b></p><p>　　除西紅柿汁、胡蘿卜汁、平菇汁之外，還分別添加了木瓜粗肽、VB

45、2、VB5、VB6、乳清蛋白、谷氨酸、纈氨酸、谷酰胺酸等生長因子。其中谷氨酸、纈氨酸、谷酰胺酸以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的添加量加入培養(yǎng)基，VB5、VB6、VB2 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%。0.25%的添加量加入，木瓜粗肽及乳清蛋白以1%、2%、3%、4%、5%的添加量加入，滅菌后按常規(guī)方法接種、培養(yǎng)、測定菌密度。</p><p><b>　　2.8 正交試驗&

46、lt;/b></p><p>　　通過上面單因子試驗確定影響乳酸菌培養(yǎng)最顯著的因素碳源、氮源及作為緩沖鹽作用的磷酸氫二鉀，采用L9(34)正交試驗法確定培養(yǎng)基。其裝液量70ml(100ml三角瓶)，接種量3.0%，培養(yǎng)溫度37℃，接種后在搖床中培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)液的OD值及菌落數(shù)。正交試驗因子及水平如下：</p><p>　　表1 L9(34)正交試驗因素水平</p>

47、<p>　　Table 1 L9 (34) factors and levels of orthogonal test</p><p>　　2.9 補料分批培養(yǎng)</p><p>　　在優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，采用補料分批培養(yǎng)方法進行乳酸菌的高密度培養(yǎng)。補料策略安排如下：</p><p>　　2.9.1 補料因素的選擇</p><

48、;p>　　2.9.1.1 補料碳源對乳酸菌培養(yǎng)的影響 </p><p>　　在前面確定的最佳培養(yǎng)條件下，分別進行以下5個方案a、b、c、d、e的碳源補料方案培養(yǎng)[11,12]（首先通過一次補料比較量，再分別比較分次補料）：2.5％、5％、7.5％的一次性投料；初始2.5％，4 h后補料2.5 ％；初始2.5％，4 h和8 h后各補料 2.5％。測定各培養(yǎng)液的菌密度。 </p><p>

49、;　　2.9.1.2 補料氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響</p><p>　　在前面確定的最佳培養(yǎng)條件下，分別進行以下5個方案a、b、c、d、e的氮源補料方案培養(yǎng)（首先通過一次補料比較量，再分別比較分次補料）：2.5％、5％、7.5％的一次性投料；初始2.5％，4 h后補料2.5 ％；初始2.5％，4 h和8 h后各補料 2.5％[11,12]。測定各培養(yǎng)液的菌密度。 </p><p>　　2.9

50、.1.3 補料一定比例的碳源和氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響 </p><p>　　在優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件下，根據(jù)前面正交試驗的結(jié)果確定的碳氮源的最佳比例，碳氮源以2:1.5的比例進行混合，然后分別進行以下5個方案A、B、C、D、 E的補料培養(yǎng)（首先通過一次補料比較量，再分別比較分次補料）：2.5％、5％、7.5％的一次性投料；初始 2.5％，4 h后補料2.5％；初始2.5 ％，4 h和8 h后各補料2.5％[11,12

51、]。測定各培養(yǎng)液的菌密度。 </p><p>　　2.9.2 補料量的優(yōu)化</p><p>　　在優(yōu)化的培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)前面正交試驗的結(jié)果確定的碳氮源的最佳比例，碳氮源以2:1.5的比例進行混合，然后分別進行以下5個方案A、B、C、D、 E的補料培養(yǎng),補料總量分別為1.5%、4.5%、7.5%、10.5%、15%，每一個量的因素在補料總量不變的情況下分別進行一次、兩次、三次補料。以

52、補料總量1.5%為例，有a、b、c三個方案，即：1.5%一次性補料；初始0.75%，4h后補料0.75%；初始0.5%，4h和8h后各補料0.5%。依次類推。測定各培養(yǎng)液的菌密度。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　通過對乳酸菌高密度培養(yǎng)的條件接種量、PH值、培養(yǎng)時間、氮源、碳源、緩沖鹽、生長因子等單因素的試驗，確定正交試驗的因素

53、及水平，再采用L9(34)正交試驗和方差分析篩選各因素水平的最佳組合，在此條件下用補料分批法進行乳酸菌高密度培養(yǎng)。</p><p>　　3.1培養(yǎng)條件的單因素試驗</p><p><b>　　3.1.1 接種量</b></p><p>　　將乳酸菌接種量作為一個因素，研究其對乳酸菌高密度培養(yǎng)的影響。結(jié)果如下圖：</p><p

54、>　　圖 3.1 不同接種量對乳酸菌OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.1 Effect of different inoculability quantity on OD</p><p>　　由圖3.1可知，在一定范圍內(nèi)，OD值隨著接種量的增加而增大，接種量為3%時乳酸菌的OD值達到最大，之后又有所下降。由以上結(jié)果可知，不同接種量對最終菌密度有一定影響，接種量大，菌體增

55、殖速度快，發(fā)酵周期短，從而減少污染雜菌的機會，但是由于菌體增殖快，產(chǎn)酸量大，使生長過早進入衰亡期造成菌體自溶；接種量小，延滯期長，菌體增殖速度慢，發(fā)酵周期延長。從多方面考慮，確定3%為較合適的接種量。</p><p><b>　　3.1.2 pH值</b></p><p>　　乳酸菌在生長過程中，細胞對氫離子有一個自我調(diào)節(jié)機制，能把代謝中產(chǎn)生的氫離子不斷排出胞外，以保

56、證胞內(nèi)一個相對優(yōu)良的生長環(huán)境，這也是為什么乳酸菌相對更耐酸的部分原因。但當(dāng)胞外氫離子濃度達到一定程度后，胞內(nèi)氫離子往外排放也會受阻，積累過多就會對細胞造成損傷[13]。所以在制作酸奶發(fā)酵劑的過程中，有必要通過控制胞外氫離子濃度，緩解乳酸菌細胞內(nèi)部調(diào)節(jié)pH的壓力，達到增殖菌體數(shù)量和減少活性損失的目的。</p><p>　　每種微生物都有自己的pH值適宜范圍。而微生物細胞對pH值的改變是很敏感的，環(huán)境中的氫離子濃度如

57、果超過了微生物的適應(yīng)范圍，就會降低或抑制這些微生物的生命活動。在乳酸菌生長的最適pH值范圍內(nèi)，細菌不僅生長繁殖快，而且活力強。為了確定最佳初始濃度，在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時分別把初始pH值調(diào)至7.5、7.0、6.5、6.0，接入相同條件的菌種，24h后測定各樣品的菌密度，結(jié)果如圖:</p><p>　　圖 3.2 不同pH對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.2 Effect of

58、different pH on OD</p><p>　　從試驗結(jié)果看，初始pH值為6.5和自然pH6.42時，菌密度達到最高。初始pH值過低或過高，都不利于乳酸菌生長。由于MRS培養(yǎng)基的自然pH值為6.42，因此在配制培養(yǎng)基的時候可以不調(diào)pH值，在自然pH值的條件下接種培養(yǎng)乳酸菌。</p><p><b>　　3.1.3 溶氧量</b></p><

59、;p>　　在培養(yǎng)過程當(dāng)中，溶氧濃度的高低對菌體生長、產(chǎn)物的合成以及產(chǎn)物的性質(zhì)都會產(chǎn)生不同的影響。一般認(rèn)為乳酸菌為微好氧菌和專性厭氧菌，對其培養(yǎng)也多采用厭氧培養(yǎng)箱進行厭氧培養(yǎng)，但是，現(xiàn)在也有人通過實驗證實了靜止培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)也可以獲得較高的細菌數(shù)[14]。史媛英和肖冬光在他們的研究中指出[15]，在乳酸菌進行搖瓶培養(yǎng)的過程當(dāng)中，活菌的個數(shù)會隨溶氧量的增加而增加，但是當(dāng)溶氧量過高時，活菌的個數(shù)反而會有所下降。這說明乳酸菌的生長對氧含量

60、有一定范圍的要求。</p><p>　　一般來說，溶氧量對乳酸菌的濃縮培養(yǎng)的影響不像其他好氧菌培養(yǎng)的影響那樣大。在本實驗中，測定結(jié)果顯示，不同的搖床轉(zhuǎn)速下OD值大小差距不大，即溶氧量對乳酸菌的生長繁殖影響不大。</p><p>　　3.1.4 培養(yǎng)時間</p><p>　　在前面優(yōu)化的培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，為了進一步了解菌體在此培養(yǎng)基中的生長過程，更準(zhǔn)確的掌握其生長情況

61、，繪制了菌體OD值變化曲線，從而掌握乳酸菌的最佳培養(yǎng)時間，具體變化情況如下圖：</p><p>　　圖3.3 乳酸菌OD值變化曲線</p><p>　　Fig. 3.3 OD600 variety during the growth process</p><p>　　由圖3.3可以看出，乳酸菌經(jīng)過2~4h左右的遲滯期后OD值開始激增， 15h后達到高峰，進入平穩(wěn)期

62、，此后菌密度基本不再增加。本實驗培養(yǎng)觀測了24小時，若繼續(xù)培養(yǎng)下去菌密度應(yīng)該會下降，那是因為菌體開始自溶。綜上所述，乳酸菌的最適收獲期為15h，此時細胞積累量最大。</p><p>　　3.2 培養(yǎng)基成分的單因素實驗 </p><p><b>　　3.2.1 碳源</b></p><p>　　通過在培養(yǎng)基中加入不同的碳源 ：蔗糖 、葡萄糖、麥芽

63、糖、乳糖四種碳源 ，研究了其對乳酸菌生長的影響，對基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化加入量。實驗結(jié)果如下圖：</p><p>　　圖3.4 不同碳源對OD值的影響 圖3.5 不同碳源量對OD值的影響 </p><p>　　Fig. 3.4 Effect of different carbon

64、Fig. 3.5 Effect of different carbon </p><p>　　source on OD source amount on OD</p><p>　　由圖3.4可知，葡萄糖是乳酸菌生長繁殖的最佳碳源，由圖3.5進一步可知，葡萄糖的適宜加入量是2%。</p><p>&

65、lt;b>　　3.2.2 氮源</b></p><p>　　通過在培養(yǎng)基中加入不同的氮源：蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀和尿素四種氮源，研究了其對乳酸菌生長的影響，對基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并在確定最佳氮源的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化加入量。根據(jù)實驗結(jié)果繪制如下圖表：</p><p>　　圖3.6 不同氮源對OD值的影響 圖3.7 不同氮源量對OD值的影響&

66、lt;/p><p>　　Fig. 3.6 Effect of different nitrogen Fig. 3.7 Effect of different nitrogen </p><p>　　source on OD source amount on OD</p><

67、;p>　　從圖中顯而易見，蛋白胨是乳酸菌生長繁殖的最佳氮源，適宜的加入量是1%。此外，尿素尤其不適合作為乳酸菌培養(yǎng)基的氮源。</p><p><b>　　3.2.3 緩沖鹽</b></p><p>　　當(dāng)pH值降低至4.0以下時，菌體的生長繁殖受到抑制作用[15]，因此要選擇一種符合要求的緩沖物質(zhì)，在培養(yǎng)階段調(diào)整生長培養(yǎng)基的pH值，提高菌密度及活菌數(shù)。由于乳酸菌

68、在代謝過程中能分解糖類產(chǎn)生大量有機酸類，其中主要是乳酸，隨著發(fā)酵進程的繼續(xù)，乳酸含量逐漸增加，致使培養(yǎng)基的酸度升高，乳酸菌的繁殖便被抑制甚至死亡。為了促進乳酸菌的生長繁殖，可預(yù)先在發(fā)酵培養(yǎng)液中加入對乳酸菌生長無影響或有促進作用的緩沖溶液，以調(diào)節(jié)和控制發(fā)酵液pH的相對穩(wěn)定，保證乳酸菌生長繁殖必需的條件。</p><p>　　根據(jù)一些報道[16,17]本實驗選取K2HPO4和NaAc兩種緩沖鹽，分別加一種或兩種或都不

69、加，進行單因素試驗，并在確定適宜緩沖鹽的基礎(chǔ)上進行量的優(yōu)化，結(jié)果見圖3.8-3.9。</p><p>　　圖3.8 不同緩沖鹽對OD值的影響 圖3.9 緩沖鹽的添加量對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.8 Effect of different buffer on OD Fig. 3.9 Effect of buffer amount

70、on OD </p><p>　　根據(jù)圖3.8和3.9很明顯可以看出，乳酸菌生長繁殖的最適緩沖鹽是磷酸氫二鉀，優(yōu)化量是1.5%。</p><p>　　3.2.4 生長因子</p><p>　　大多數(shù)乳酸菌是生長因子異養(yǎng)型微生物，它們需要從外界提供維生素等多種生長因子，雖然生長因子的需求量很少，但它對乳酸菌的正常代謝必不可少，在促進其生長方面起著重要的作用[18,1

71、9]。為了測定各生長因子對乳酸菌生長的影響，除了選擇目前報道較多的番茄汁、平菇浸汁和胡蘿卜汁三種物質(zhì)作為生長因子外，還選擇了木瓜粗肽、VB2、VB5、VB6、乳清蛋白、谷氨酸、纈氨酸、谷酰氨酸等進行單因素試驗，但是其中大多數(shù)因子對乳酸菌的生長繁殖沒有顯著影響，甚至VB6 還有抑制作用，只有VB5 和谷酰胺酸的影響較顯著。結(jié)果如圖4.10-4.11。</p><p>　　圖3.10 維生素B5的添加量對OD值的影響

72、 圖3.11 谷酰氨酸的添加量對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.10 Effect of VB5 amount on OD Fig. 3.11 Effect of glutamyl amount on OD</p><p>　　根據(jù)上圖3.10可知，維生素B5的最佳添加量是0.15%，圖3.11可知，谷酰氨酸的最佳添加量是0.5%

73、。</p><p><b>　　3.3 正交試驗</b></p><p><b>　　3.3.1正交分析</b></p><p>　　從單因素的分析中，可以判斷得出碳源，氮源，緩沖鹽這三個因素對于乳酸菌生長繁殖的影響最大，因此將這三個因素作為正交試驗的三個水平，進一步優(yōu)化確定乳酸菌高密度培養(yǎng)最佳的條件[20、21]。<

74、;/p><p>　　表2 正交試驗結(jié)果及分析</p><p>　　Table 2 Results and analysis of orthogonal test</p><p>　　由上表可確定優(yōu)化方案為：B>A>C,即氮源為最主要因素，其次為碳源，本試驗中緩沖鹽影響最小，分析原因可能是因為所選的三個水平的緩沖鹽都是比較適宜的[22]。根據(jù)OD值的極差分析可

75、知，優(yōu)化方案是B3A2C1，即氮源1.5%，碳源2%，緩沖鹽1%。</p><p>　　3.3.2 極差趨勢圖分析</p><p>　　圖3.12 不同因素對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.12 Effect of different factors on OD</p><p>　　通過極差趨勢圖可看出，主要影響因素B(氮源)

76、含量在1.5%時，對應(yīng)的OD值最大，因此選擇1.5%作為氮源的最佳添加量；碳源添加量在2%時，OD值最大，因此，2%是理想的碳源添加量；緩沖鹽的添加量在1%時，OD值達到最大，因此，1%是理想的緩沖鹽添加量。故也可以得到最佳培養(yǎng)方案B3A2C1。</p><p>　　3.3.3 方差分析</p><p>　　表3 正交試驗方差分析</p><p>　　Table3

77、 Analysis of variance of orthogonal test</p><p>　　通過方差分析（表3），可以看出，在顯著性水平0.1上，碳源、氮源對試驗結(jié)果有顯著影響，而緩沖鹽無顯著影響。 </p><p>　　3.4 補料分批培養(yǎng)</p><p>　　3.4.1 補料因素選擇</p><p>　　3.4.1.1 補料碳

78、源對乳酸菌培養(yǎng)的影響 </p><p>　　培養(yǎng)基初始pH值6.5左右，接種量3%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間24h。根據(jù)測得的菌密度實驗結(jié)果繪制如下圖表：</p><p>　　圖3.13 補料碳源對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.13 Effects of feeding batch carbon source on OD</p>&l

79、t;p>　　從圖3.13中顯而易見，一次性投料的a、b、c三個方案中，方案c的菌密度最高。另外，d、e二種分批補料培養(yǎng)方案都比一次性投料方案要好，而且方案e 的菌密度比d方案高。不過各個方案菌密度大小差距都不是很大。</p><p>　　3.4.1.2 補料氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響 </p><p>　　培養(yǎng)基初始pH值6.5左右，接種量3%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間24h。測得菌密度

80、的結(jié)果如圖：</p><p>　　圖3.14 補料氮源對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.14 Effects of feeding batch nitrogen source on OD</p><p>　　根據(jù)上圖可知，一次性投料的a、b、c三個方案中，方案b的菌密度最高。另外，d、e二種分批補料培養(yǎng)方案要比a、c兩種一次性投料方案要好，但是e方案

81、比b和d方案菌密度要小，可能是氮源補料過多反而抑制了乳酸菌的生長。另外，d、e方案分別比b、c方案要好，說明在補料總量不變的情況下，分批補料比一次性投料要好。不過各個方案菌密度大小差距也不是很大。</p><p>　　3.4.1.3 補料一定比例的碳源和氮源對乳酸菌培養(yǎng)的影響</p><p>　　圖3.15 補料一定比例碳氮源對OD值的影響</p><p>　　Fi

82、g. 3.15 Effects of feeding batch in specific C／N ratio on OD</p><p>　　培養(yǎng)基初始pH值6.5左右，接種量3%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間24h。由上圖可知，一次性投料的A、B、C 三個方案中，其中方案C的菌密度最高，但是和方案A、C的結(jié)果相差不大。另外，D、E二種補料培養(yǎng)方案都比一次性投料方案要好，而且方案 E測得菌密度比D高很多，同時E方案也

83、比單獨補料碳源或氮源中的e方案要好很多，因此，采用一定比例的碳氮源作為補料因素進行分批補料最好。 </p><p>　　3.4.2 補料量的優(yōu)化</p><p>　　在確定補料因素，即一定比例碳氮源的基礎(chǔ)[23]上，根據(jù)C/N比例2:1.5進行補料。在最佳培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基初始pH值6.5左右，接種量3%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間24h。補料總量1.5%、4.5%、7.5%、10.5%、1

84、5%分別分三次補料，即方案A、B、C、D、E，補料時間間隔為初始補料、4h和8h后分別補料，結(jié)果如下：</p><p>　　圖3.16 分批補料一定比例碳氮源的總量對OD值的影響</p><p>　　Fig. 3.16 Effects of the total amount of feeding batch in specific C／N ratio on OD</p>&l

85、t;p>　　由圖3.16可知，方案B的菌密度最高，即一定比例碳氮源的補料總量為7.5%（每次補料2.5%）時菌密度最高，此方案最好。因此，分批補料一定比例碳氮源的補料總量的最佳值為7.5%，即初始補料2.5%，4h和8h后各補料2.5%。</p><p>　　在此基礎(chǔ)上，進一步測定方案B的活菌數(shù)，并與普通MRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)進行比較。將方案B中的菌液和在同樣條件下培養(yǎng)的普通MRS培養(yǎng)基中的菌液用平板涂布法

86、測定菌落數(shù)。培養(yǎng)48h小時后，通過平板計數(shù)法[24]數(shù)出菌落數(shù)，進一步推算可知，普通MRS培養(yǎng)基中的菌液的活菌數(shù)為4.8×108，通過高密度培養(yǎng)的菌液的活菌數(shù)為2.36×109，大大高于普通培養(yǎng)。 </p><p>　　補料分批發(fā)酵在微生物高密度培養(yǎng)中應(yīng)用較多，特別是應(yīng)用在重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)中技術(shù)已相當(dāng)成熟。在補料分批培養(yǎng)過程中，高密度發(fā)酵成功的關(guān)鍵是補料策略的選擇。它是根據(jù)菌株生長和初

87、始培養(yǎng)基的特點，在分批培養(yǎng)的某些階段以某種方式間歇地或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體及其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時間延長的培養(yǎng)方式。因此，補料分批培養(yǎng)（又稱流加培養(yǎng)）比其它培養(yǎng)方法具有更多的優(yōu)越性。賀稚非等[21]綜合運用緩沖鹽法及補料培養(yǎng)法，使培養(yǎng)液中乳酸菌的活菌數(shù)達到7.24×109CFU/ml。</p><p>　　目前，我國超濃縮酸奶發(fā)酵劑的制備技術(shù)還不完善，商業(yè)化超濃縮酸奶發(fā)酵劑國內(nèi)還沒有廠家生產(chǎn)，作為發(fā)

88、酵劑制備的核心技術(shù)，乳酸菌高密度培養(yǎng)的研究及應(yīng)用勢在必行。隨著市場需求的日益擴大，乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)必將廣泛地應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)中。如此，不僅能改進乳酸菌發(fā)酵的工藝，提升其現(xiàn)代化發(fā)酵進程，而且對增加單位體積培養(yǎng)液中的菌體數(shù)量，提高生產(chǎn)效率，加速乳酸菌發(fā)酵劑的商品化進程，更好地滿足市場需求，均具有重要而深遠的意義[23,24]?？梢灶A(yù)見，乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的市場前景十分廣闊。　</p><p><b

89、>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　4.1 通過優(yōu)化單因素培養(yǎng)條件得出：37℃下培養(yǎng)乳酸菌，其高密度培養(yǎng)的最佳接種量為3%，最佳pH值為自然pH即pH6.5左右，溶氧量對乳酸菌菌種-戊糖乳桿菌的生長影響不大。另外，由生長曲線可知，0~4h為遲滯期，4-15h為對數(shù)生長期，15~24h為穩(wěn)定期，菌密度基本不再增加，因此最佳培養(yǎng)時間為20h。</p><p>　　4.

90、2 通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分得出：37℃下培養(yǎng)乳酸菌，其高密度培養(yǎng)的最佳碳源為葡萄糖，適宜量為2%，最佳氮源為蛋白胨，適宜量為1%，最佳緩沖鹽為磷酸氫二鉀，適宜量為1.5%，生長因子中，0.15%的VB5 和0.5%的谷酰胺酸的影響較為顯著，其余因素相對不顯著。</p><p>　　4.3 通過對三個最顯著的單因素（碳源、氮源、緩沖鹽）進行正交試驗(L9(34))得出：氮源1.5%，碳源2%，緩沖鹽1%是乳酸菌生長繁殖

91、的最適宜條件。</p><p>　　4.4通過補料分批培養(yǎng)方法得出的最佳補料策略是：補料碳氮源比單獨補料碳源或者碳源要好，而且分批補料一定比例碳氮源（2:1.5）的補料總量的最佳值為7.5%，即初始補料2.5%，4h和8h后各補料2.5%。通過補料分批培養(yǎng)法進行高密度培養(yǎng)的最終活菌數(shù)為2.36×109，遠高于普通培養(yǎng)4.8×108。 </p><p><b>

92、　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Egon Bech Hansen. Commercial bacterial starter cultures for fermented foods of the future[J].Int.J.Food Microbio,2002,(78):119-131.</p><p>　　[2] 劉振民,駱承庠.乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)工程技

93、術(shù)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26 (4):68-72.</p><p>　　[3] 山麗杰,田洪濤,賈英民等.濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑制備中幾個技術(shù)關(guān)鍵問題的探討[J].中國乳品工業(yè),2002,30 (5):66-69.</p><p>　　[4] Riesen berg D, Gut hke R . High cell density cultivation of microorgan

94、isms Appl. Micrbiol. Biotechol. 1999, (51):422-430.</p><p>　　[5] 熊曉輝,熊強,陸利霞.乳酸菌發(fā)酵劑高密度培養(yǎng)的研究[J].中國調(diào)味品,2004(5):17-21.</p><p>　　[6] Ogbonna J C,Markl H. Nutrient－split feeding syrategy for dialys

95、is cultivation of E.coil. Biotiechnol Bloeng,1993,41:1092-1099.</p><p>　　[7] 靳志強,郝林,李平蘭等.德氏乳桿菌保加利亞亞種高密度培養(yǎng)的研究初探[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(2):4-8.</p><p>　　[8] 陸利霞,熊強,熊曉輝.乳酸桿菌半連續(xù)式高密度培養(yǎng)的研究[J].研究與探索,2005(1

96、2):47-49.</p><p>　　[9] 葉明,李太元,李艷茹等.蝌蚪元乳酸菌的人工高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].動物生產(chǎn),2009,45(5):50-52.</p><p>　　[10] 谷長維,李太元,常巧呈等. 犬源乳酸菌高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007,19(3):251-255.</p><p>　　[11] 熊濤,徐立榮,范鐳等

97、.蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌的菌體高密度培養(yǎng)[J].食品科學(xué),2007(1):345-349.</p><p>　　[12] 李平蘭.補料分批法高密度培養(yǎng)德氏乳桿菌保加利亞亞種S-1[J].中國乳品工業(yè),2007,35(1):4-9.</p><p>　　[13] 李瑩,周劍忠,董明盛.乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J].乳品加工,2008(3):44-46.</p><p&g

98、t;　　[14] 呂嘉瀝,丁博.濃縮乳酸菌發(fā)酵劑的濃縮培養(yǎng)的研究進展[J].食品科技,2007(6):5-8.</p><p>　　[15] 吳祖芳,翁佩芳.樓佳瑜.乳酸菌的高密度培養(yǎng)及發(fā)酵劑保藏技術(shù)的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(10):5-9.</p><p>　　[16] 呂為群,駱承庠.乳酸菌在冷凍干燥過程中存活率的影響因素探討[J].中國乳品工業(yè),1993,21

99、(5):217-220</p><p>　　[17] 呂兵,張國農(nóng),楊瑞歡.嗜酸乳桿菌生物學(xué)特性及其發(fā)酵乳的研究[J].中國乳品工業(yè),2002,30(5):37-39.</p><p>　　[18] 柏建玲,莫樹平,鄭婉玲等.乳酸菌增菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)因子優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(2):79-81.</p><p>　　[19] 劉云鶴,何煜波.肉品發(fā)

100、酵劑增殖培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2002,28(3):234-236</p><p>　　[20] 史嬡英,肖冬光.酸奶發(fā)酵劑高濃度培養(yǎng)的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,1999(1):20-25.</p><p>　　[21] 賀稚非,向瑞璽,李洪軍等.泡菜活性直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究[J].食品科學(xué),2006,27(8):191-197.</p&g

101、t;<p>　　[22] Ulrich Kulozik and Ju¨rgen Wilde.Rapid lactic acid production at high cell concentrations in whey ultrafiltrate by Lactobacillus helveticus. Biotechol. 1999,(21):365-403.</p><p>　　[2

102、3] A. Olmos-Dichara, F. Ampe, J.-L. Uribelarrea, A. Pareilleux? and G. Goma .Growth and lactic acid production by Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus in batch and membrane bioreactor: in?uence of yeast extract and Trypton