乳酸菌畢業(yè)設(shè)計論文

1、<p>　　畢業(yè)設(shè)計報告（論文）</p><p>　?。?2013 屆）</p><p><b>　　課題名稱： </b></p><p>　　指導(dǎo)教師： </p><p>　　班 級： 5555 </p>

2、<p>　　學(xué)生姓名： </p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　乳酸菌是一類以糖為原料，主要產(chǎn)物為乳酸的細(xì)菌的總稱，其重要性已經(jīng)引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。乳酸菌產(chǎn)生的具有抑菌作用的物質(zhì)——細(xì)菌素，具有無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性，同時也不污染環(huán)境等優(yōu)點，已成為生物食品防腐研究的重點，并被認(rèn)為是

3、最有效的抗生素替代物。乳酸菌在醫(yī)療、生物防治、食品、飼料和發(fā)酵等領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。</p><p>　　本文主要以市售進(jìn)口奶酪為研究對象，采用BCG培養(yǎng)基分離出單個的細(xì)菌菌落，通過觀察菌落形態(tài)、菌體形態(tài)觀察篩選出5株乳酸菌，通過抑菌實驗，在5株乳酸菌中篩選得到1株具有高抑致病菌活性的乳酸菌菌株GL5，通過菌株形態(tài)學(xué)特征的觀察與生理生化特征的鑒定，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，該菌株與干酪乳桿菌最相似。<

4、/p><p>　　關(guān)鍵詞：乳酸菌；抑菌；鑒定 </p><p><b>　　Abstracts</b></p><p>　　Lactic acid bacteria is a kind of the umbrella name taking that candy is raw material, main outcome as the

5、lactic acid bacterium, it's significance already arouses broad home and abroad attention. Having that the Lactic acid bacteria produces or the bacterium effect matter bacterium is plain, innocuous, there is no the si

6、de effect, the nothing being left over, there is no resistance to drugs, the environment contaminating at the same time neither waits for merit, already becomes the priority tha</p><p>　　The BCG medium was u

7、sed to isolate the single conlony from the cheese in the supermarket. Five kinds of lactic acid bacteria were screened based on the morphological characteristics, and according to the bacteriostatic experiment, GL5 from

8、cheese had the highest bacteriostatic activity. GL5 was homologous with Lactobacillus casei based on the morphological ,physiological characteristics and Bergey's manual of determinative bacteriology.</p><

9、p>　　Key words：Lactic acid bacteria, bactriostasis, indentification </p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘 要............................................................Ⅰ</p><

10、p>　　Abstracts.........................................................Ⅱ</p><p>　　目 錄............................................................Ⅲ</p><p>　　第1章 前 言..........................

11、...........................1</p><p>　　1.1乳酸菌的生理功能.............................................1</p><p>　　1.2乳酸菌的類型.... ............................................2</p><p>　　1.3乳酸菌的

12、研究歷史.............................................2</p><p>　　1.4乳酸菌的工業(yè)用途.............................................2</p><p>　　1.5乳酸菌細(xì)菌素.................................................2</p&g

13、t;<p>　　第2章 材料與方法...................................................4</p><p>　　2.1 材料........................................................4</p><p>　　2.2 方法.............................

14、...........................5</p><p>　　第3章 結(jié)果與分析..................................................9</p><p>　　3.1抑菌實驗結(jié)果................................................9</p><p>　　3.2抑菌

15、物質(zhì)的確定..............................................9</p><p>　　3.3乳酸菌的鑒定...............................................10</p><p>　　第4章 結(jié)論........................................................13

16、</p><p>　　4.1分離純化結(jié)果................................................ 13</p><p>　　4.2抑菌試驗的結(jié)果.............................................. 13 4.3鑒定結(jié)果...............................................

17、..... 13</p><p>　　致謝............................................ ..................14</p><p>　　參考文獻(xiàn)..........................................................15</p><p><b>　　第1章

18、 前言</b></p><p>　　乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸菌的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌。這是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，目前至少可分為18個屬，共有200多種。除極少數(shù)外，其中絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國內(nèi)外生物學(xué)家所證實，腸內(nèi)乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關(guān)系

19、。</p><p>　　乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。乳酸菌能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸，因而得名。益生菌能夠幫助消化，有助人體腸臟的健康，因此常被視為健康食品，添加在酸奶之內(nèi)。 </p><p>　　1. 1 乳酸菌的生理功能</p><p>　　在人體腸道內(nèi)棲息著數(shù)百種的細(xì)菌，其數(shù)量超過百萬億個。其中對人體健康有益的叫益生菌，以乳酸菌、雙歧桿菌等為代表，對人

20、體健康有害的叫有害菌，以大肝桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌等為代表。益生菌是一個龐大的菌群，有害菌也是一個不小的菌群，當(dāng)益生菌占優(yōu)勢時（占總數(shù)的80%以上），人體則保持健康狀態(tài)，否則處于亞健康或非健康狀態(tài)。長期科學(xué)研究結(jié)果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它們數(shù)量的多和少，直接影響到人的健康與否，直接影響到人的壽命長短，科學(xué)家長期研究的結(jié)果證明，乳酸菌對人的健康與長壽非常重要。 </p>

21、<p>　　而人體腸道內(nèi)乳酸菌擁有的數(shù)量，隨著人的年齡增長會逐漸減少，當(dāng)人到老年或生病時，乳酸菌數(shù)量可能下降100至1000倍，直到老年人臨終完全消失。在平時，健康人比病人多50倍，長壽老人比普通老人多60倍。因此，人體內(nèi)乳酸菌數(shù)量的實際狀況，已經(jīng)成為檢驗人們是否健康長壽的重要指標(biāo)?，F(xiàn)在，由于廣譜和強(qiáng)力的抗菌素的廣泛應(yīng)用，使人體腸道內(nèi)以乳酸菌為主的益生菌遭受到嚴(yán)重破壞，抵抗力逐步下降，導(dǎo)致疾病越治越多，健康受到極大的危脅。所以

22、，有意增加人體腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量就顯得非常重要。目前國際上公認(rèn)的乳酸菌，被認(rèn)為是最安全的菌種，也是最具代表性的腸內(nèi)益生菌，人體腸道內(nèi)以乳酸菌為代表的益生菌數(shù)量越多越好。也完全符合諾貝爾得獎?wù)呱飳W(xué)家梅契尼柯夫“長壽學(xué)說”里所得出的結(jié)論，乳酸菌=益生菌=長壽菌。 </p><p>　　乳酸菌的生理功能[1]具體有：</p><p>　　1、防治有色人種普遍患有的乳糖不耐癥（喝鮮奶時出現(xiàn)的腹脹

23、、腹瀉等癥狀）。 </p><p>　　2、促進(jìn)蛋白質(zhì)、單糖及鈣、鎂等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生維生素B族等大量有益物質(zhì)。 </p><p>　　3、使腸道菌群的構(gòu)成發(fā)生有益變化，改善人體胃腸道功能，恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護(hù)人體健康。</p><p>　　4、抑制腐敗菌的繁殖，消解腐敗菌產(chǎn)生的毒素，清除腸道垃圾。</p><p&g

24、t;　　5、抑制膽固醇吸收，降血脂、降血壓作用。</p><p>　　6、免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)人體免疫力和抵抗力。</p><p>　　7、抗腫瘤、預(yù)防癌癥作用。</p><p>　　8、提高SOD酶活力，消除人體自由基，具抗衰老、延年益壽作用。</p><p>　　9、有效預(yù)防女性泌尿生殖系統(tǒng)細(xì)菌感染。</p><p>

25、;　　1.2 乳酸菌的類型</p><p>　　乳酸菌大體上可分為兩大類。一類是動物源乳酸菌，一類是植物源乳酸菌。因為動物源取自動物，因菌種常處于相對不穩(wěn)定狀態(tài)，其生物功效也較不穩(wěn)定，且在大量食用時，很容易導(dǎo)致人體動物蛋白過敏，即排斥反應(yīng)。而植物源乳酸菌，因為取自植物易被人體認(rèn)可，不論攝取多大的量，人體不會產(chǎn)生異體蛋白排斥反應(yīng)，且植物源乳酸菌比動物源者更具有活力，能比動物源多8倍的數(shù)量到達(dá)人體小腸內(nèi)定植，從而發(fā)揮

26、其強(qiáng)大而穩(wěn)定的生物功效。 </p><p>　　1.3 乳酸菌的研究歷史</p><p>　　早在20世紀(jì)初，俄國著名的生物學(xué)家梅契尼柯夫（Mechnikoff,1845-1916），在他獲得諾貝爾獎的“長壽學(xué)說”里已明確指出，保加利亞的巴爾干島地區(qū)居民，日常生活中經(jīng)常飲用的酸奶中含有大量的乳酸菌，這些乳酸菌能夠定植在人體內(nèi)，有效地抑制有害菌的生長，減少由于腸道內(nèi)有害菌產(chǎn)生的毒素對整個機(jī)體

27、的毒害，這是保加利亞地區(qū)居民長壽的重要原因。這個具有劃時代意義的“長壽學(xué)說”，為人類利用乳酸菌生產(chǎn)健康食品開創(chuàng)了新紀(jì)元。今天，利用乳酸菌生產(chǎn)的健康食品已經(jīng)一躍成為全世界關(guān)注的健康食品。 </p><p>　　早在5000年前人類就已經(jīng)在使用乳酸菌。到目前為止，人類日常食用的泡菜、酸奶、醬油、豆豉等，都是應(yīng)用乳酸菌這種原始而簡單的隨機(jī)天然發(fā)酵的代謝產(chǎn)物。</p><p>　　1.4 乳酸菌的

28、工業(yè)用途</p><p>　　乳酸菌多數(shù)為同型發(fā)酵，如鏈球菌屬（Streptococcus），是與人類關(guān)系密切的重要菌群，有些菌是人和溫血動物的致病菌；有些是人體的正常菌群存在于口腔和腸道；有些是乳制品及植物發(fā)酵食品中的常用菌，常在食品工業(yè)中使用，如乳鏈球菌（S．lactis）。少數(shù)為異型發(fā)酵，如腸膜狀明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是制藥工業(yè)上生產(chǎn)右旋糖酐（即代血漿）的重要菌種，但

29、也是制糖工業(yè)的一種有害菌，常使糖汁發(fā)粘稠而無法加工。 </p><p>　　1.5 乳酸菌細(xì)菌素</p><p>　　乳酸桿菌在胃腸道內(nèi)能夠產(chǎn)生細(xì)菌素，抑制病原菌的作用，而且乳酸桿菌屬的細(xì)菌都是無毒副作用的，因此是一類很有前途的益生素生產(chǎn)菌種(Ewing和Cole,1994)。乳酸菌是正常人畜腸道中極為重要的生理菌群，擔(dān)負(fù)著人畜機(jī)體多種重要的生理功能，具有維持人體中微生態(tài)平衡作用。而且，乳

30、酸菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸(如乳酸、丁酸和醋酸等)、過氧化氫和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)[1]。這些抑菌物質(zhì)不僅不破壞食品的風(fēng)味和組織狀態(tài)，還可以抑制腐敗菌和病原菌的生長，從而防止腐敗，延長食品的保藏期。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素以其對動物無毒性，易被人體消化道中的蛋白酶降解，不會在體內(nèi)蓄積引起不良反應(yīng)等特性，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑[2]。本實驗欲從進(jìn)口干酪中分離乳酸菌，并研究各種乳酸菌對食品中常見致病菌的抑制作用。</p

31、><p>　　由于乳酸菌來源于食品,其無毒副作用、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點受到人們的關(guān)注。乳酸菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生一系列物質(zhì),能夠抑制或殺死一些食物腐敗菌,其中起主要抑菌作用的是細(xì)菌素,其具有一定的熱穩(wěn)定性,易被人體消化道的部分蛋白酶降解,并且不會在體內(nèi)積蓄引起不良反應(yīng)。因此，乳酸菌制劑作為一種天然防腐保鮮劑，有著廣闊的市場前景。</p><p><b>　　第2章 材料與方法<

32、;/b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p><b>　　2.1.1 樣品</b></p><p><b>　　市售進(jìn)口奶酪</b></p><p><b>　　2.1.2 培養(yǎng)基</b></p><

33、p>　　1、BCG培養(yǎng)基：A、B液滅菌后混勻。</p><p>　　A液：脫脂奶粉50g,1.6%溴甲酚綠酒精液0.35ml,蒸餾水250ml.(90℃，開蓋滅菌10min)</p><p>　　B液：酵母膏5g,瓊脂10g,蒸餾水250ml。(PH 6.8 , 121℃滅菌20min) A、B液滅菌后在無菌狀態(tài)下混勻后倒平板。</p><p>　　2、MRS

34、 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三銨1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐溫80 1.0g、蒸餾水1000mL。(PH 6.2～6.4 , 121℃ , 滅菌20min)。</p><p>　　3、PY培養(yǎng)基（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母提取物1.0

35、g，無機(jī)鹽溶液4.0mL（鹽溶液成分:無水CaCl2 0.2g，MgSO4 20.0g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g，將CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸餾水中，再加500mL蒸餾水，一邊攪拌一邊緩慢加入其他鹽類，繼續(xù)攪拌直到全部溶解，加蒸餾水定容至1000mL，混合后貯備于4℃)。</p><p>　　4、PYG培養(yǎng)基：PY在基礎(chǔ)

36、培養(yǎng)液內(nèi)加入1.0g葡萄糖。</p><p>　　5、SS培養(yǎng)基：牛肉粉5g、月示胨5g、三號膽鹽8.5、枸櫞酸鈉8.5g、乳糖10g、枸櫞酸鐵1g、硫代硫酸鈉8.5g、中性紅0.025g、煌綠0.00033g、瓊脂17g、蒸餾水1000mL。</p><p>　　2.1.3 指示菌種</p><p>　　單增李斯特菌（Listeria monocytogens）、

37、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、大腸桿菌（Escherichia coli）：均購于廣東微生物菌種保藏中心。</p><p><b>　　2.1.4 試劑</b></p><p>　　脫脂奶粉：光明乳業(yè)股份有限公司；

38、</p><p>　　1.6%溴甲酚綠酒精溶液：自配；</p><p>　　瓊脂：生化試劑,福建泉州市泉港化工廠；</p><p>　　酵母膏：生化試劑,原上海酵母廠；</p><p>　　蛋白胨：生化試劑,上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站中心化工廠；</p><p>　　牛肉膏：生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；<

39、;/p><p>　　葡萄糖：分析純試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；</p><p>　　乙酸鈉：分析純試劑,成都科龍化工試劑廠；</p><p>　　檸檬酸三銨：分析純試劑,上海試四赫維化工有限公司；</p><p>　　磷酸氫二鉀：分析純試劑,上海光鏵科技有限公司；</p><p>　　MgSO4·7H2O：分

40、析純試劑,上海美興化工有限公司；</p><p>　　MnSO4·4H2O：分析純試劑,上海美興化工有限公司；</p><p>　　吐溫80（聚山梨酯-80）：分析純試劑,上海申宇醫(yī)藥化工有限公司。</p><p>　　2.1.5 儀器和設(shè)備</p><p>　　LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；</

41、p><p>　　SHP-150恒溫培養(yǎng)箱：上海山連實驗設(shè)備有限公司；</p><p>　　電子顯微鏡：上海欣茂儀器有限公司；</p><p>　　CA-1390-1垂直層流潔凈工作臺：上海上凈凈化設(shè)備有限公司；</p><p>　　電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；</p><p>　　FL-1可調(diào)式封閉式電爐：北京

42、市永光明醫(yī)療儀器廠；</p><p>　　GL-21M高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所有限公司；</p><p>　　其他器材：燒杯、玻璃棒、吸量管、洗耳球、膠頭滴管、涂布棒、試管等。2.2方法</p><p>　　2.2.1 樣品的處理</p><p>　　奶酪的處理：以無菌操作取奶酪1g，放入含有9mL滅菌加熱至含40℃左右的生理鹽水

43、的滅菌廣口瓶內(nèi)，待奶酪溶解制成1:10的均勻稀釋液，并用無菌生理鹽水逐級稀釋至10-3、10-4、10-5。</p><p>　　2.2.2 乳酸菌的分離純化</p><p>　　采用BCG牛乳培養(yǎng)基對稀釋樣品中的微生物通過平板傾注法進(jìn)行分離純化。以無菌操作取奶酪稀釋液10-3、10-4、10-5 各0.1mL置于滅菌后的平板中，加入15mL BCG牛乳培養(yǎng)基，帶培養(yǎng)基凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱

44、中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果稍扁平的黃色菌落，周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，初步定為乳酸菌[3]。</p><p>　　2.2.3 革蘭氏染色</p><p>　　洗片→載玻片上滴一滴蒸餾水→玻璃棒蘸取一滴菌液在玻片上→晾干→結(jié)晶紫初染1min→水洗→晾干→碘液媒染30s→水洗→晾干→95%酒精脫色20s→水洗→晾干→番紅復(fù)染→水洗→晾干→鏡檢。</p><p>　　2

45、.2.4 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)</p><p>　　配制MRS液體培養(yǎng)基，分裝到試管中(每管約15mL),將選出的菌種接種到試管中在37℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24h，在接種到小三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)24h。</p><p>　　2.2.5 乳酸菌的抑菌實驗---管碟法</p><p>　　將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液進(jìn)行離心(條件: 10000r/min,10min)；</p>&

46、lt;p>　　在培養(yǎng)皿中加入約15ml的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；</p><p>　　待第一層培養(yǎng)基冷卻后，加入混有致病菌的培養(yǎng)基約15ml；</p><p>　　待培養(yǎng)基冷卻后，加入牛津杯進(jìn)行固定；</p><p>　　在牛津杯中加入菌液及無菌水進(jìn)行對照(等邊三角形)；</p><p>　　將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(條件:37℃,24

47、h)。 </p><p>　　2.2.6 抑菌物質(zhì)的確定</p><p>　　2.2.6.1酸對乳酸菌抑菌活性的影響</p><p>　　初篩菌株的發(fā)酵上清液，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5或用乳酸調(diào)節(jié)改良MRS液體培養(yǎng)基pH值與發(fā)酵上清液的pH值相同，參照抑菌試驗所述方法作抑菌活性對比。</p><p>　　2.2.6.2過

48、氧化氫對乳酸菌抑菌活性的影響</p><p>　　過氧化氫酶溶解在50mmol /L 的磷酸緩沖液( pH=7.0 )中配成母液,加入到發(fā)酵液中使過氧化氫酶的終濃度為5mg/mL,在37℃水浴中溫育2h后取出,檢測過氧化氫酶處理后發(fā)酵液的抑菌活性。</p><p>　　2.2.6.3酶對發(fā)酵上清液抑菌效果的影響</p><p>　　篩選菌株發(fā)酵上清液分別用1mg/m

49、L的蛋白酶K、胰蛋白酶處理（37℃、1h），然后進(jìn)行抑菌試驗，同時設(shè)未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液作為對照。</p><p>　　2.2.7：乳酸菌的鑒定</p><p>　　乳酸菌的鑒定包括形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實驗，具體參見根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）》與《乳酸細(xì)菌分類鑒定與實驗方法》。</p><p>　　2.2.7.1 形態(tài)學(xué)觀察</p><p

50、>　　挑選出產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株，在合適的培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h，待長出單菌落觀察其菌落特征，并進(jìn)行革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其觀察菌體形狀、排列方式、有無芽孢等個體形態(tài)特征、菌體革蘭染色結(jié)果。</p><p>　　2.2.7.2 生理生化實驗</p><p><b>　　1、過氧化氫酶測定</b></p><p>　　將實驗菌接種于PYG

51、培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)20h—24h，取一環(huán)接種的培養(yǎng)物，涂于干凈的載玻片上，然后在其上滴加3%－15%的過氧化氫，有氣泡則為陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。</p><p><b>　　2、精氨酸產(chǎn)氨實驗</b></p><p>　　接種試驗菌于含精氨酸的培養(yǎng)基中，并同時接種于不含精氨酸的培養(yǎng)作為對照。置37℃培養(yǎng)培養(yǎng)1-3d。取已生長好的培養(yǎng)液少許置于比色盤內(nèi)，加奈

52、氏試劑數(shù)滴，當(dāng)產(chǎn)氨時出現(xiàn)橙黃或黃褐色沉淀。含精氨酸培養(yǎng)中的培養(yǎng)液與試劑的反應(yīng)顯示強(qiáng)于對照液才能認(rèn)為是陽性反應(yīng)。因為有些菌尚能利用培養(yǎng)基中的蛋白胨產(chǎn)氨，二者不可混同。</p><p><b>　　3、明膠液化實驗</b></p><p>　　將實驗菌接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)，以一支未接種的試管作為對照。將接種的和未接種的對照管置于冰箱或冷水中，等待對照管凝固后記

53、錄實驗結(jié)果，反復(fù)觀察對比多次。如對照管凝固時，接種管液化為陽性反應(yīng)，凝固為陰性反應(yīng)。</p><p><b>　　4、吲哚實驗</b></p><p>　　將試驗菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中,37℃下培養(yǎng)48h以上。在培養(yǎng)液中加入乙醚1～2mL，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑(加入吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察)

54、，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。</p><p><b>　　5、產(chǎn)硫化氫實驗</b></p><p>　　將普通濾紙剪成約0.5-0.6cm寬的紙條，長度根據(jù)試管和培養(yǎng)基高度而定。用濃度為50~100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，然后置于烘干，放入培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，滅菌后備用。將新鮮試驗菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)液后，用無菌的鑷子夾取一乙

55、酸鉛紙條懸掛于接種管內(nèi)。下端接近培養(yǎng)基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。試驗中設(shè)空白對照，在未接種的試管培養(yǎng)上懸掛乙酸鉛紙條。另外接種已知菌的陰性反應(yīng)作對照。置于37℃培養(yǎng)培養(yǎng)1-3d，進(jìn)行觀察比較，紙條變黑為陽性反應(yīng)。</p><p><b>　　6、糖發(fā)酵實驗</b></p><p>　　將需要測定的糖或醇類等碳水化合物加入PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝含5mL培養(yǎng)基的試

56、管。分別取0.2mL鑒定菌株接到滅菌后的碳水化合物培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，振蕩培養(yǎng)。檢測時取培養(yǎng)液少許置于比色盤內(nèi)，同時取未加碳水化合物的PY培養(yǎng)液作為對照，滴加試劑比較顏色的變化，記錄產(chǎn)酸的強(qiáng)弱。</p><p>　　2.2.8：乳酸菌的保藏</p><p>　　將具有較強(qiáng)抑菌活性的乳酸菌活化培養(yǎng)，并加入一定的保護(hù)劑[4]，在-76 ℃及真空下凍干3 d后，放-20 ℃冰箱貯藏。<

57、;/p><p><b>　　第3章 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 抑菌實驗結(jié)果</p><p>　　通過BCG培養(yǎng)基，從進(jìn)口奶酪中共篩選出5株乳酸菌。經(jīng)管碟法抑菌實驗驗證，從奶酪中分離出的2株乳酸菌（分別命名為GL1和GL5）對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌都有很好的抑制作用，結(jié)果見表1。其中，

58、GL5抑菌效果最佳，如圖1所示。</p><p>　　圖1 GL5菌株抑金黃色葡萄球菌實驗結(jié)果</p><p>　　表1 三種乳酸菌對各指示菌的抑菌圈直徑（單位：mm）</p><p>　　各種乳酸菌對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌，這種抑制特性可能與細(xì)菌之間的同源性有關(guān)。</p><p>　　3. 2 抑菌物質(zhì)的確定</p&

59、gt;<p>　　3. 2.1 酸對乳酸菌抑菌活性的影響</p><p>　　在排除酸的作用后, 將GL5發(fā)酵液及用酸處理后的發(fā)酵液利用管碟法以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗，仍有一定的抑菌作用,見表2。</p><p>　　表2　 GL5原始發(fā)酵上清液及調(diào)節(jié)pH后的抑菌圈大小</p><p>　　3. 2.2 過氧化氫對乳酸菌抑菌活性的影響<

60、;/p><p>　　乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的強(qiáng)氧化劑過氧化氫也可以抑制細(xì)菌的生長,尤其是抑制G-菌的生長,因此必須排除過氧化氫的干擾[5]。發(fā)酵上清液用過氧化氫酶處理,以未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液為對照,以金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗,結(jié)果見表3。</p><p>　　表3　 GL5原始發(fā)酵上清液及過氧化氫酶處理后的抑菌圈大小</p><p>　　3. 2.3

61、 酶對發(fā)酵上清液抑菌效果的影響</p><p>　　在排除有機(jī)酸和過氧化氫對指示菌的抑制作用后,為了確定抑菌物質(zhì)是否具有蛋白質(zhì)性質(zhì),實驗用胰蛋白酶、蛋白酶K對發(fā)酵液進(jìn)行處理，用處理后的發(fā)酵液作抑菌實驗，檢測抑菌能力是否降低，實驗結(jié)果見表4。</p><p>　　表4　 GL5原始發(fā)酵上清液及蛋白酶處理后的抑菌圈大小</p><p>　　3. 3 乳酸菌的鑒定<

62、/p><p>　　3. 3.1 形態(tài)學(xué)觀察</p><p>　　表5 三種乳酸菌的形態(tài)特征</p><p>　　圖1 GL5菌的革蘭氏染色圖片</p><p>　　3. 3.2 生理生化特征鑒定</p><p>　　生理生化特征鑒定主要實驗項目包括在不同溫度（15℃、35℃和45℃）試驗菌種的生長情況，在不同pH值（p

63、H4.5、5.4、9.0）培養(yǎng)基中生長情況，過氧化氫酶實驗，運動性檢查，明膠液化實驗，吲哚實驗，硫化氫產(chǎn)生實驗，精氨酸產(chǎn)氨實驗與糖發(fā)酵實驗。</p><p>　　表6 GL5菌株生理生化試驗結(jié)果</p><p>　　在含有2%蔗糖的的張良MRS培養(yǎng)液中。</p><p>　　“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。</p><p>　　根據(jù)菌

64、種的形態(tài)特征與生理生化特性，根據(jù)參考資料[6，7]，將GL5初步鑒定為乳桿菌屬。接著對GL5菌株進(jìn)行糖發(fā)酵實驗，實驗結(jié)果如表7所示。</p><p>　　表7 GL5菌株糖發(fā)酵試驗結(jié)果</p><p>　　注：“+，-”同上；○表示弱陽性。</p><p>　　根據(jù)生理生化實驗結(jié)果，參考資料[6，7]，經(jīng)過刪選比對，菌株GL5的生理生化特性與干酪乳桿菌最相似。<

65、;/p><p><b>　　第4章 結(jié)論</b></p><p><b>　　4.1分離純化結(jié)果</b></p><p>　　利用BCG培養(yǎng)基分離出市售干酪中單菌落，經(jīng)觀察菌落形態(tài)與革蘭氏染色初步判定為乳酸菌。</p><p>　　4.2抑菌試驗的結(jié)果</p><p>　　從市

66、售奶酪中分離出的5種乳酸菌分別編號為GL1-GL5 。染色后顯微鏡觀察，均為革蘭氏陽性菌，均為桿狀菌。</p><p>　　通過對5種指示菌進(jìn)行抑菌試驗，通過管碟法抑菌實驗篩選出一種來源于進(jìn)口奶酪的抑致病菌活性較高的乳酸菌GL5。</p><p><b>　　4.3鑒定結(jié)果</b></p><p>　　通過形態(tài)學(xué)觀察與生理生化實驗，菌株GL5初

67、步鑒定為干酪乳桿菌。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 楊潔彬，葛興華．乳酸菌生物學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，1996．</p><p>　　[2] 朱小喬，劉通訊．極具潛力的天然防腐劑——Nisin[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（4）：66-69．</p><

68、p>　　[3] 喬發(fā)東，吳秀芳，南慶賢，等。濃縮乳酸菌發(fā)酵劑的現(xiàn)狀[J]。中國乳品工業(yè)，1998，（1）：30-32.</p><p>　　[4] 吳玲，潘道東，劉海燕.瑞士乳桿菌凍干保護(hù)劑的選擇.食品與機(jī)械，2010，26（1）：157-159.</p><p>　　[5] 姚麗婭,徐為民,諸永志.產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及鑒定.食品工業(yè)科技，2008，29（1）：160-164.&l