水產(chǎn)品中氟甲喹殘留檢測方法研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計)</p><p>　題 目：水產(chǎn)品中氟甲喹殘留檢測方法研究</p><p>　學 院：</p><p>　學生姓名：</p><p>　專 業(yè)：藥學</p><p>　班 級：</p><p>　指導(dǎo)教師：</p>

2、<p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘 要...........................................................1</p><p>　　Abstract...........................................

3、..............2</p><p><b>　　1 前言3</b></p><p><b>　　1.1概述3</b></p><p>　　1.2氟甲喹的化學結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)3</p><p>　　1.3氟甲喹的作用機理4</p><p>　　2 實驗材料、主

4、要儀器與試劑4</p><p>　　2.1 實驗材料4</p><p><b>　　2.2 儀器4</b></p><p>　　2.3 主要試劑4</p><p><b>　　3 實驗方法5</b></p><p>　　3.1 標準曲線的制備5</p>

5、<p>　　3.1.1 標準溶液的配制5</p><p>　　3.1.2 最佳條件的選擇5</p><p>　　3.1.3 標準曲線的繪制5</p><p>　　3.2 儀器精密度的檢測6</p><p>　　3.3 檢測限和定量限6</p><p>　　3.4 提取方法6</p>

6、<p>　　4 實驗結(jié)果與討論6</p><p>　　4.1高效液相色譜最佳檢測條件的選擇6</p><p>　　4.1.1 檢測波長的選擇6</p><p>　　4.1.2 流動相的選擇7</p><p>　　4.1.3 流速的選擇7</p><p>　　4.2 標準曲線如圖3、圖4所示9&

7、lt;/p><p>　　4.3 精密度的檢測10</p><p>　　4.4 氟甲喹的檢測限和定量限10</p><p>　　4.4.1 用公式法計算10</p><p>　　4.4.2 用逐級稀釋法測10</p><p>　　4.5 樣品前處理方法及回收率分析11</p><p>　　4

8、.5.1 提取溶劑的選擇11</p><p>　　4.5.2 回收率實驗11</p><p>　　4.5.3 雜質(zhì)峰分析11</p><p><b>　　5小結(jié)12</b></p><p><b>　　參考文獻12</b></p><p>　　致 謝錯誤!未

9、定義書簽。</p><p>　　水產(chǎn)品中氟甲喹殘留檢測方法研究</p><p>　　[摘要]用高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中氟甲喹的殘留量，用醋酸乙腈和無水硫酸鈉作為提取液，勻漿、離心、濃縮。結(jié)果表明檢測水產(chǎn)品中氟甲喹殘留的高效液相色譜最佳條件如下：紫外光檢測，檢測波長為248nm，流動相為0.1%甲酸水：乙腈（40:60），柱溫為35℃。氟甲喹的標準曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，精密度為0

10、.35%，對帶皮的魚肉組織進行六種濃度的回收率檢測測定，其回收率在84~90%之間。結(jié)果證明此方法能夠滿足魚肉中氟甲喹殘留的簡便、快捷、高效檢測。</p><p>　　[關(guān)鍵詞]氟甲喹；水產(chǎn)品；殘留；高效液相色譜法</p><p>　　Research of Detection method of Flumequine Drug Residues in Aquatic Products&l

11、t;/p><p>　　[Abstract] High-performance liquid chromatographic method for determining residues of flumequine in aquatic products.With acetic acid acetonitrile and no water sodium as extract,homogenate,centrifuga

12、l,enrichment.The results show that the best conditions of high-performance liquid chromatographic to detect the flumequine’s residues in aquatic products as follows:ultraviolet detector;detected wavelength is 248nm;mobil

13、e phase is 1% formic acid water:acetonitrile(40:60);column temperature is 35℃;the</p><p>　　[Key words] Flumequine；Aquatic products；Residue；High-performance liquid chromatographic method</p><p>&

14、lt;b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1概述　</b></p><p>　　喹諾酮類（Quinolones）藥物是一類人工合成的人畜共用抗生素類藥物，對革蘭氏陰性菌和陽性菌、支原體、衣原體等有抗菌作用，常被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害防治。隨著人們對食品安全問題的關(guān)注，漁藥殘留問題不僅成為各國相關(guān)部門關(guān)注的焦點，也是普通民眾關(guān)心的社

15、會問題。</p><p>　　氟甲喹(Flumequine，F(xiàn)Q)屬喹諾酮類抗菌藥物，此類藥物抗菌譜廣、療效顯著、價格低廉、不易產(chǎn)生交叉耐藥性，因此被廣泛用于人體和動物的多種感染性疾病的預(yù)防和治療。隨著這類藥物的大量使用，會在動物體內(nèi)殘留，人類食用也會對人類的健康帶來隱患，造成神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的損害。目前，歐盟[81]規(guī)定在動物肌肉中氟甲喹的最大殘留量為200μg/kg，日本為600μg/kg，我國農(nóng)

16、業(yè)部[82]規(guī)定氟甲喹的最大殘留量為500μg/kg。因此，很有必要建立一種高效、快速分離檢測喹諾酮類藥物的方法。</p><p>　　目前，水產(chǎn)品中氟甲喹殘留量的檢測方法主要有高效液相色譜法[83-87]、高效液相色譜-質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等[98-89]。微生物檢測法靈敏度較低、檢出限無法達到歐盟所規(guī)定的最高殘留量。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法大大提高了靈敏度，并且可以進行定性分析，可以滿足國際對微量藥物殘留的

17、檢測，但儀器較為昂貴，很難廣泛應(yīng)用。</p><p>　　本研究采用的是最常用的檢測方法——高效液相色譜法，該方法具有使用范圍廣、選擇性強、分析速度快、檢測靈敏度高等優(yōu)點，可用于水產(chǎn)品中氟甲喹的含量測定。</p><p>　　1.2氟甲喹的化學結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) </p><p>　　分子式：C14H12FNO3</p><p>　　分子量：26

18、1.25</p><p><b>　　中文名：氟甲喹</b></p><p>　　英文名稱：Flumequine(FQ)</p><p>　　別名：luoro-6,7-dihydro-5-methyl-1-oxo-1H,5H-benzo[ij]quinolizine-2- carboxylic acid</p><p>

19、　　產(chǎn)品名稱：氟甲喹; 9-氟-6,7-二氫-5-甲基-1-氧代-1H,5H-苯并(ij)喹嗪-2-羧酸 </p><p>　　理化性質(zhì)：白色粉末，無臭、無味，不溶于水，能和有機溶劑互溶。</p><p>　　1.3氟甲喹的作用機理 </p><p>　　氟甲喹通過抑制細菌核酸的合成，阻止細菌ＤＮＡ復(fù)制達到殺菌的效果。主要用于畜禽細菌性呼吸道病，大腸桿菌，白痢，沙門

20、氏菌病，傷寒，禽霍亂，葡萄球菌病傳染性鼻炎等。水產(chǎn)動物的大腸桿菌病，單孢菌屬和弧球菌屬病，嗜水氣單胞菌有強烈的抑制作。</p><p>　　2 實驗材料、主要儀器與試劑</p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　赤紅魚肉，在陰涼處解凍后，加少量1%醋酸乙腈粉碎備用。</p><p><

21、;b>　　2.2 儀器</b></p><p>　　表1 實驗所用儀器名稱、型號及廠家</p><p><b>　　2.3 主要試劑</b></p><p>　　表2 實驗所用試劑及其規(guī)格、廠家</p><p><b>　　3 實驗方法</b></p><p&

22、gt;　　3.1 標準曲線的制備 </p><p>　　3.1.1 標準溶液的配制</p><p>　　用分析天平精密稱取氟甲喹標準品1mg，用乙腈定容在10ml的容量瓶中，振搖溶解制成0.1mg/ml的氟甲喹標準溶液置于冰箱中以4℃保存。</p><p>　　3.1.2 最佳條件的選擇</p><p>　　根據(jù)氟甲喹的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及查閱的相關(guān)

23、資料，分別設(shè)置波長為324nm和248nm進樣檢測，確定最佳檢測波長。</p><p>　　配制0.1%甲酸水溶液，分別以V乙腈：V甲酸水的比例為90:10,80:20,70:30,和60:40的流動相，取1ml上述標準溶液進樣，記錄峰面積和保留時間，確定流動相最佳配比。</p><p>　　在流動相最佳配比條件下，分別設(shè)置流速為0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、

24、1.0ml/min。進樣檢測，并記錄峰面積和保留時間，確定檢測最佳流速。</p><p>　　注意每次進樣之前色譜柱至少需要平衡15min，重復(fù)進標準溶液，當峰面積變化±10% 以內(nèi)，保留時間±5% 以內(nèi)，方可正式開始進樣。</p><p>　　3.1.3 標準曲線的繪制 </p><p>　　取上述濃度為0.1mg/ml的氟甲喹標準溶液1ml

25、用高效液相色譜儀紫外檢測器在最佳條件下進樣檢測。進樣系列標準溶液進樣量分別為5、10、15、20、25、30μL。所有檢測樣品相應(yīng)值應(yīng)在線性濃度范圍以內(nèi)。以上每一進樣量進3針，按每一針所得峰面積的平均值與對應(yīng)的標準溶液濃度作標準曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，及作數(shù)據(jù)回歸分析。</p><p>　　3.2 儀器精密度的檢測</p><p>　　取氟甲喹標準溶液1ml用高效液相色譜儀在最佳進

26、樣檢測條件下，平行進樣六次，記錄實驗所得峰面積，并計算其RSD值。</p><p>　　3.3 檢測限和定量限</p><p>　　取上述氟甲喹標準溶液0.5mL于進樣瓶中，加入0.5mL乙腈進行稀釋，搖勻后進樣，測信噪比，同樣方法依次對前一稀釋好的溶液進行逐步稀釋，搖勻后分別測其信噪比，直到所得的信噪比為10和3，記錄此時的氟甲喹乙腈溶液濃度，即為氟甲喹的檢測限和定量限。</p&g

27、t;<p><b>　　3.4 提取方法</b></p><p>　　分別取肌肉樣品1g、0.8g、0.6g、0.4g、0.2g、0.1g，各加入0.1mg/ml的氟甲喹標準溶液1ml，振搖超聲10min后，依次加入1%（V/V）醋酸乙腈6ml、4.8ml、3.6ml、2.4ml、1.2ml、0.6ml和無水硫酸鈉0.6g、0.48g、0.36g、0.24g、0.12g、0.0

28、6g，超聲溶解20min后，4℃離心5min后，取上清液倒入另一離心管中，再依次加入乙腈飽和正己烷2ml、1.6ml、1.2ml、0.8ml、0.4ml、0.2ml，振搖10min，4℃離心5min后，取乙腈層于電熱恒溫水槽蒸干，1ml乙腈溶解，過0.45μm濾膜，進樣檢測。</p><p><b>　　4 實驗結(jié)果與討論</b></p><p>　　4.1高效液相色

29、譜最佳檢測條件的選擇</p><p>　　4.1.1 檢測波長的選擇</p><p>　　氟甲喹屬于喹諾酮類藥，喹諾酮類藥物含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外可見區(qū)有較強吸收，根據(jù)所查資料及實驗所得結(jié)果分析該藥在248nm有最大吸收。</p><p>　　圖1 不同檢測波長條件下所得的圖譜</p><p>　　4.1.2 流動相的選擇</p>

30、<p>　　喹諾酮類藥物分子上含有堿性集團和羧基，屬于兩性化合物，在水溶液中通常以離子形式存在，利用高效液相色譜進行分析時容易產(chǎn)生色譜峰拖尾的現(xiàn)象，通常選擇在流動相中加入適當?shù)碾x子對緩沖液。因為乙腈具有低粘度和高電滲流的雙重優(yōu)點，用乙腈作為有機相時可以有效縮短分析時間。根據(jù)前實驗結(jié)果及相關(guān)資料顯示，選用乙腈-甲酸水體系、乙腈-乙酸體系時色譜峰拖尾嚴重，選用乙腈-磷酸鹽緩沖液作為流動相時，靈敏度不如乙腈-甲酸水體系。所以最終選

31、擇乙腈-甲酸銨體系作為流動相，所得峰形尖銳、靈敏度高、基線平穩(wěn)。</p><p>　　表3 不同配比流動相的保留時間和峰面積</p><p>　　流動相中有機溶劑所占的比例對保留時間和分離效果有很大的影響。乙腈比例增加，流動相極性減小，物質(zhì)保留時間也會隨著減小。實驗考查了不同比例乙腈-甲酸水流動相體系下的出峰時間和峰面積，結(jié)果表明，當乙腈比例增大時，氟甲喹標準溶液檢測時的保留時間縮短，但峰

32、面積下降，降低乙腈的比例，保留時間也隨之變長，峰面積增加，故確定流動相為乙腈：甲酸水=60：40(V/V)。</p><p>　　4.1.3 流速的選擇</p><p>　　表4 不同流速的保留時間和峰面積</p><p>　　實驗考查了不同流速條件下，進行標準溶液中氟甲喹的檢測，實驗結(jié)果顯示，高效液相色譜柱流通面積相對較大，隨著流量的增加，兩種藥物的保留時間明顯縮

33、短，當流量過大時，會造成柱內(nèi)藥物流失過快，影響柱效及檢測穩(wěn)定性，過小則影響出峰時間，根據(jù)物質(zhì)出峰時間和靈敏度等幾方面考慮，最終選擇0.6ml/min為最佳流速。</p><p>　　圖2 流速為0.4ml/min時測得的圖譜</p><p>　　圖3 流速為0.4ml/min時測得的圖譜</p><p>　　在以上優(yōu)化的條件下，乙腈：甲酸水=60：40(V/V)為流

34、動相，流速：0.6mL/min，紫外檢測波長為：248nm，柱溫：35℃時，檢測效果最好。在最優(yōu)色譜工作條件下，標準溶液在8min左右即可出峰，標準色譜圖見圖2</p><p>　　圖4 最佳條件下氟甲喹標準溶液的圖譜</p><p>　　4.2 標準曲線如圖3、圖4所示</p><p>　　表5 最佳條件下制標準曲線所得的數(shù)據(jù)</p><p&g

35、t;<b>　　圖5 標準曲線1</b></p><p><b>　　圖6 標準曲線2</b></p><p>　　根據(jù)標準曲線圖所示，氟甲喹標準溶液在0.03~0.2mg/mL范圍內(nèi)線性良好范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。</p><p>　　4.3 精密度的檢測</p><p>　　

36、表6 儀器精密度檢測的數(shù)據(jù)</p><p>　　根據(jù)以上實驗結(jié)果計算得RSD值為0.35%，由此可以看出，該方法精密度高、重復(fù)性好。</p><p>　　4.4 氟甲喹的檢測限和定量限</p><p>　　4.4.1 用公式法計算</p><p>　　用excel對數(shù)據(jù)進行線性處理及回歸分析。并根據(jù)公式</p><p>

37、;　　LOD=3.3*殘差平方和/斜率</p><p>　　LOQ=10*殘差平方和/斜率</p><p>　　Excel所得殘差平方和為2.21E-6，代入上述公式計算得氟甲喹的檢測限和定量限分別為1.04和3.16mg/mL。</p><p>　　4.4.2 用逐級稀釋法測</p><p>　　用excel對數(shù)據(jù)進行線性處理及回歸分析所得

38、的結(jié)果遠比查閱資料所得的要大，所以最后還是選擇以逐級稀釋法逐步檢測，測得的結(jié)果分別為檢測限：1ng/mL，定量限：5ng/mL。</p><p>　　4.5 樣品前處理方法及回收率分析</p><p>　　4.5.1 提取溶劑的選擇</p><p>　　為了最大效率的將水產(chǎn)品中氟甲喹從魚肌肉中提取出來，根據(jù)相關(guān)資料顯示，實驗采用1%(V/V)醋酸乙腈和無水硫酸鈉、以

39、及乙腈飽和正己烷作為提取劑，離心后樣品組織及硫酸鈉沉淀在離心管下層，給轉(zhuǎn)移提取液帶來極大的便宜，所以回收率相對較高。其中水產(chǎn)樣品含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，在提取過程中有效的沉淀蛋白會提高萃取率和減少雜質(zhì)的干擾，乙酸是很好的蛋白質(zhì)沉淀劑，并且樣品處理前預(yù)先加入無水NaSO4，可以除去樣品中多余水分，還可以使樣品處理過程中不易結(jié)團。加入正己烷可最大程度的脫去樣品中脂肪，提高回收率。</p><p>　　4.5.2 回收率

40、實驗</p><p>　　回收率實驗可以衡量方法的準確度，取不同量的空白魚樣添加相同量的氟甲喹標準溶液，按照之前實驗方法中提取藥物的方法得到提取液后，對每一濃度溶液進行3次回收率實驗，結(jié)果如表5所示。從表中可看出，所得溶液的回收率在84%~90%之間。</p><p>　　表7 最佳條件下測魚肌肉中氟甲喹回收率所得的實驗結(jié)果</p><p>　　實驗所得的回收率雖

41、然較高，但仍然有提升回收率的空間?；叵雽嶒灢僮鞑襟E，主要可以從以下幾方面改善：1）取肌肉樣品加入1%醋酸乙腈和無水硫酸鈉超聲離心后，肌肉樣品中可能還存在部分藥品殘留，實驗過程中，1%醋酸乙腈和無水硫酸鈉可以分多次加入到肌肉樣品中，進行多次提取；2）在取上清液過程中，可能沒把上清液完全取出，導(dǎo)致部分藥物隨殘留在肌肉樣品的液體一起殘留在離心管中，如（1）中提出的那樣分多次加醋酸，然后分次提取可能會減少上清液的殘留，或者用針筒吸也可以減少上清

42、液的殘留；3）對所取得的上清液中加入一定量的乙腈飽和正己烷，振搖離心后，在取乙腈層的過程中由于正己烷在上層，本人采取的是直接從離心管中用吸管將正己烷去除，這步可能會導(dǎo)致部分含有氟甲喹藥物的乙腈層被吸走，從而降低了被檢測藥品的回收率，這步需要實驗操作者的細心和耐心，從而減少不必要的損失。</p><p>　　4.5.3 雜質(zhì)峰分析</p><p>　　圖5 最佳條件下測魚肌肉中氟甲喹回收率所

43、得的圖譜</p><p>　　根據(jù)檢測所得圖譜（如圖5）顯示，該圖譜中存在有一些雜質(zhì)峰，即該實驗所得回收液中存在有雜質(zhì)，回想實驗過程中的操作步驟，主要存在以下幾種原因：1）取肌肉樣品加入1%醋酸乙腈和無水硫酸鈉超聲離心后，肌肉樣品中的脂肪、蛋白等雜質(zhì)有可能溶解在上清液中，在取上清液的時候，雜質(zhì)隨著上清液一起被取出；2）對所取得的上清液中加入一定量的乙腈飽和正己烷，振搖離心后，在取乙腈層的過程中由于正己烷在上層，本

44、人采取的是直接從離心管中用吸管將正己烷去除，這一步驟有可能導(dǎo)致部分正己烷殘存在離心管中，而且正己烷中還有可能包含有魚肌肉樣品中的脂肪、蛋白等雜質(zhì)。3）實驗操作過程中，也有可能因為實驗操作不夠嚴謹而造成部分雜質(zhì)進入進樣瓶。</p><p><b>　　5小結(jié)</b></p><p>　　本實驗旨在研究高效液相色譜紫外檢測法檢測水產(chǎn)品中氟甲喹殘留量的方法。通過對樣品前處理

45、中提取、凈化和色譜條件等環(huán)節(jié)進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為：樣品經(jīng)醋酸乙腈提取，在紫外檢測波長為248nm；柱溫：35℃；流速：0.6ml/min；進樣量15μL；流動相：0.1%甲酸水：乙腈（40:60）條件下進行檢測，該方法回收率高、檢出限滿足檢測要求，具有溶劑消耗量少、分析速度快等優(yōu)點。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 劉春

46、娥,劉峰.水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010,03.</p><p>　　[2] 魏博娟.水產(chǎn)品中多種喹諾酮類藥物殘留量檢測方法的研究.集美大學碩士學位論文, 2011,06.</p><p>　　[3] 朱品玲,陳舒奕,梁劍,謝森清.HPLC同時檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的殘留[J].科技創(chuàng)業(yè)月刊,2008,01.</p><p>　　[

47、4]李佐卿,倪梅林,章再婷,謝東華.高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留[J].現(xiàn)代科學儀器，16卷3期</p><p>　　[5]仲鋒,董琳琳,汪霞.惡喹酸、氟甲喹在魚組織中殘留量的檢測方法研究[J]中國獸藥雜志2002.36(11):20-22.</p><p>　　[6] 梁增輝,林黎明,劉靖靖,江志剛,宮慶禮.惡喹酸和氟甲喹在鰻魚體內(nèi)的藥代動力學研究[J] 海洋水產(chǎn)研究 20

48、06.06,第27卷第3期</p><p>　　[7] 三種紅外探測器的頻率響應(yīng)測里及其信噪比的改進[J]紅外與激光技術(shù).1989年01期</p><p>　　[8] 邊永玲,李秀娟,郭建.氟喹諾酮類獸藥殘留檢測方法研究進展[J].中國農(nóng)學通報,2008,24(6): 28- 31.</p><p>　　[9] 黃曉蓉,鄭晶,李壽崧等.鰻魚及其制品中喹諾酮類藥物殘留

49、的微生物快速檢測方法[J].淡水漁業(yè), 2005,35(4): 3- 6.</p><p>　　[10] 郭根和,潘葳,蘇德森等.離子對高效液相色譜法同時測定魚類中4種喹諾酮類藥物的殘留[J].色譜,2005,23(4):401-403.</p><p>　　[11] 李慧芳,殷軍港,劉永明. 魚肉中喹諾酮類藥物殘留檢測前處理方法的研究[J]中國漁業(yè)質(zhì)量與標準 2012年03月第2卷第3期

50、</p><p>　　[12]J.R.Meinertz,V.K.Dawson,W.H.Gingerich,B.Cheng,M.M.Turbergen,J. Assoc.Off. Anal.Chem.77(1994)871.</p><p>　　[13] R.K. Munns, S.B. Turnipseed, A.P. Pfenning, J.E. Roybal, D.C. Holland

51、, A.R. Long, S.M. Plakas, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 78 (1995) 343.</p><p>　　[14] S.M. Plakas, K.R. El Said, K.R. Bencsath, S.M. Musser, C.C. Walker, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 82 (1999) 614.</p><

52、p>　　[15] J.A. Hernandez-Arteseros, R. Compano, M.D. Prat, Chromatographia 52 (2000) 58.</p><p>　　[16]ZHAO SJ,LIC,JIANG HY,eta.l Smiultaneous determination of 7 quinolonesr- esidues in anmi almuscle tissue

53、s by high performance liquid chromatography [J].Chin JAnal Chem,2007,35(6):786-790.</p><p><b>　　附錄Ⅰ 英文翻譯</b></p><p>　　用高效液相色譜法和熒光檢測法篩選和檢測水產(chǎn)品中的惡喹酸、氟甲喹及沙拉沙星</p><p>　　【摘要】將

54、一種先前發(fā)表的用液相色譜法測定九中喹諾酮類藥物在雞、豬、牛、羊肌肉內(nèi)的殘留量的方法應(yīng)用于同時測定三種喹諾酮類藥物（噁喹酸、氟甲喹及沙拉沙星）在魚組織內(nèi)的殘留量。將從肌肉勻漿中提取的樣品用乙腈基本溶解。離心后，局部蒸發(fā)去除己烷，就可以直接注射。在PLRP-S柱分離后用可進行編程的熒光檢測器進行檢測。色譜條件的優(yōu)化是為了三種喹諾酮類藥物的檢測在一次試驗中相配。根據(jù)歐盟規(guī)定的組織樣品中每個喹諾酮類最大殘留限制沙拉沙星濃度范圍為15~120μg

55、*kg-1，惡喹酸和氟甲喹的為75~600μg*kg-1評估該方法的線性范圍、回收率、準確度和精密度。對沙拉沙星、惡喹酸和氟甲喹各自的檢測限大約為2.5~7μg*kg-1 。沙拉沙星的定量限為15μg*kg-1、惡喹酸和氟甲喹的為75μg*kg-1 。水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的平均回收率為56.9%~70.0%。這一簡單而快速的方法適用于殘留監(jiān)控。</p><p><b>　　引言</b><

56、;/p><p>　　由于喹諾酮類藥物具有高效抑制革蘭氏陰性菌的DNA促旋酶，因此常用于家畜和漁業(yè)產(chǎn)業(yè)，現(xiàn)在有一個嚴格的立法框架嚴格控制這些藥物的使用，其目的是減少由于他們的殘留對人類健康的風險。因此，為確保人類食品安全，歐盟已制訂了這些化合物的最大殘留限量（MRL）。最近，氟甲喹的MRL被改變了。目前魚肌肉和天然皮膚內(nèi)氟甲喹的MRL被定為600μg*kg-1，惡喹酸的為300μg*kg-1，沙拉沙星的為30μg*kg

57、-1。</p><p>　　氟甲喹 惡喹酸 沙拉沙星</p><p>　　許多高效液相色譜法和熒光檢測法已經(jīng)出版了喹諾酮類藥物在魚組織內(nèi)的檢測。沒有任何一種發(fā)表的方法描述三種喹諾酮類藥物在魚組織內(nèi)的同時測定。</p><p>　　在我們實驗室里一種有三個色譜的多重殘留方法用于檢測動物肌肉內(nèi)的喹諾酮類藥

58、物（環(huán)丙沙星、達氟沙星、雙氟沙星、恩氟沙星、氟甲喹、馬波沙星、萘啶酸、惡喹酸和沙拉沙星）已經(jīng)被開發(fā)出。本研究的目的是為了運用此方法在一次實驗中對魚樣和對包括沙拉沙星在內(nèi)的吡酮酸喹諾酮類抗菌藥物測定三種喹諾酮類藥物的MRL水平。</p><p><b>　　實驗</b></p><p>　　用于提取魚組織(鮭魚和鱒魚)中喹諾酮類藥物殘留物的提取工藝本質(zhì)上與以前做過一些修

59、改的提取方法是相同的。一個試劑、儀器及提取工藝的更詳細的描述已經(jīng)被預(yù)先報道過。一個簡短的提取工藝描述如下。</p><p><b>　　2.1標準溶液 </b></p><p>　　用甲醇氫氧化鈉0.001mol/L溶液將每種參照化合物在琥珀色容量瓶中溶解成濃度為0.75g/L儲藏液。儲藏液在+4℃至少穩(wěn)定保存3個月。用pH值9.0的緩沖液稀釋沙拉沙星儲備液制成一個中

60、間標準溶液（75mg/ml）。另一個中間標準溶液是用pH值9.0的緩沖液稀釋惡喹酸和氟甲喹的儲備液。通過用pH值9.0的緩沖液得到的標準液在+4℃至少穩(wěn)定保存2周。</p><p><b>　　2.2色譜儀器 </b></p><p>　　色譜系統(tǒng)由一個ThermoQuest CLHP P4000泵，一個ThermoQuest自動進樣針，及一個200μl的注射環(huán)，和一

61、個從Prolabo得到的熒光檢測器模型(Nogent sur Marne, France)。維持在50℃的分析柱是一個商業(yè)聚合體PLRP-S柱(150×4.6mm, 5μm, 100 A° ),它是從一個配有RP18E,4×4mm(Merck, Darmstadt, Germany).前柱的Polymer Laboratories (Marseille, France)中獲得的。乙腈在0.02mol/L磷酸

62、溶液中的線性梯度，用的pH值為2.2：在接下來的注射前用20~45%的乙腈洗（12min），然后45%乙腈(5分鐘)，45~20%的乙腈(2min)和20%的乙腈洗(3min)。流量是0.8ml/min，熒光檢測器應(yīng)如表1所示的設(shè)置，用一個PC1000計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)通過SP4510 ThermoQuest接口獲取數(shù)據(jù)。</p><p><b>　　2.3分析方法</b></p>

63、<p><b>　　2.3.1提取步驟</b></p><p>　　鮭魚或鱒魚肌肉用一個Moulinett混合器解凍并絞碎，然后準確稱取0.50±0.01g的碎肌肉放入一個2ml的微型離心管再加入300μl pH為9.0的緩沖液（250μl以免樣品凝固）。樣品離心旋轉(zhuǎn)1min，并靜置15min。然后加入200μl的乙腈和肌肉一起用超聲波探頭（功率60 W、頻率20千赫）

64、研磨20秒。這個探頭用2×400μl乙腈沖洗，將溶劑收集到微型離心管。在17000g和+4℃條件勻漿旋轉(zhuǎn)1min和離心3min。然后將400μl的水相轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，及100μl注射到色譜系統(tǒng)。</p><p>　　表1 喹諾酮類藥物的熒光檢測波長</p><p>　　Table 1 Wavelengths program for the fluorescent detec

65、tion of the quinolones</p><p>　　2.3.2分析方法的確定</p><p>　　探測器響應(yīng)的線性是通過分析四種標準溶液的校準點如沙拉沙星的濃度范圍為15~120μg/L，惡喹酸和氟甲喹的為75~600μg/L檢測的。標準曲線是根據(jù)分析物的濃度對峰面積繪制的，通過方差分析檢測線性和適合度。分析步驟的線性和適合度也可以通過使用鮭魚肌肉與已知量的喹諾酮類藥物濃度范

66、圍包括沙拉沙星的15、30、60和120μg/Kg及惡喹酸和氟甲喹的75、150、300和600μg/Kg進行檢測。每一濃度水平在4天進行3次重復(fù)試驗。固定樣品的分析與其相應(yīng)的標準溶液對比計算出回收率。劑量的回收也是檢查學生的評量表。準確性是衡量誤差的，即計算值與理論濃度間的百分差別。如ISO標準5725-2描述的那樣計算一天內(nèi)和一天間的重復(fù)性。高效液相色譜系統(tǒng)的檢測限利用熒光檢測器從20個有代表性的空白樣品，在三次信噪比，根據(jù)電子商務(wù)

67、委員會93/256 / EEC推薦的進行檢測。強化的肌肉樣品在MRL水平下也可以進行穩(wěn)定性研究。它們在-18℃條件下可以被立即冷凍并儲存超過6個月。</p><p><b>　　結(jié)果和討論</b></p><p>　　標準溶液、空白樣品、發(fā)生或固化的肌肉樣品對于沙拉沙星的60μg/Kg 的濃度水平及惡喹酸和氟甲喹的300μg/Kg的濃度水平會顯示出典型的色譜圖，如圖2

68、.沙拉沙星、惡喹酸和氟甲喹的保留時間分別約為6.0、11.2和15.5min。喹諾酮類藥物在梯度條件下能進行很好的色譜分離，其他喹諾酮類藥物（達氟沙星,雙氟沙星,恩氟沙星環(huán)丙沙星和萘啶酸）也進行了試驗，雙氟沙星可以在沙拉沙星中部分溶解，同樣地，萘啶酸也可以部分溶于氟甲喹。</p><p>　　在高效液相色譜試驗前的用環(huán)己烷脫酚的一步已將被運用到豬肌肉中，在分離過程中沒有干擾項顯示了這是一個具有高效特異性的色譜分離

69、方法和一個有良好選擇性的提取工藝。</p><p>　　該方法在強化的鮭魚肌肉樣品中得到了驗證以及成功地在強化的肌肉和皮膚樣品（90:10的肌肉與皮膚比例）進行了試驗。對每一個校驗和矩陣曲線都進行了線性檢測和回歸分析。線性相關(guān)系數(shù)的值（＞0.990）顯示了峰面積和喹諾酮類藥物在濃度范圍內(nèi)的濃度之間的高度相關(guān)。另外，線性檢測的F值是具有統(tǒng)計學意義的（P＜0.001）以及F值由于缺乏不顯著的適應(yīng)性標志著一個良好的線性

70、關(guān)系。</p><p>　　水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的平均回收率為56.9%~71.0%（表2）。t檢驗研究表明回收率與藥品濃度無關(guān)，日內(nèi)和日間的重現(xiàn)性的平均相對標準偏差和該方法的精密度（-4.6%~6.5%）與歐共體委員會確定的93/256 / EEC濃度范圍相一致。沙拉沙星的定量限為15μg/Kg，惡喹酸和氟甲喹的定量限為75μg/Kg。沙拉沙星、惡喹酸和氟甲喹的檢測限分別約為2.5μg/Kg和7.5μg/Kg。

71、強化的組織在-18℃條件下可以穩(wěn)定保存6個月。</p><p>　　通過高效液相色譜-質(zhì)譜分析法證實該方法已用于檢測水產(chǎn)品(鮭魚和鱒魚)組織中喹諾酮類藥物的殘留量。該方法在法國專業(yè)實驗室里已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)變成一種喹諾酮類藥物的篩選方法。此外，該方法已經(jīng)應(yīng)用于感染惡喹酸水產(chǎn)品檢測的協(xié)作研究。</p><p>　　表2 水產(chǎn)品中三種喹諾酮類藥物分析方法的回收率、準確度和精密度</p>

72、<p>　　Table 2 Recovery, accuracy and precision of the method for the three quinolones analysed in fish muscle</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　該論文介紹了用高效液相色譜法來篩選和量化在魚肌肉組織內(nèi)喹諾酮類藥物的殘留量。

73、這篇用來短時間內(nèi)獲取高通量樣品而設(shè)計的制備步驟的文章可用于篩查的目的。</p><p><b>　　感謝</b></p><p>　　本人在此感謝M.P. Fourmond和J. Blot對本研究的參與。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Y. Ikai, H

74、. Oka, N. Kawamura, M. Yamada, K.-I. Harada, M. Suzuki, H. Nakazawa, J. Chromatogr. 477 (1989) 397.</p><p>　　[2] V. Hormazabal, V.A. Rogstad, A. Steffenak, M. Yndestad, J. Liq. Chromatogr. 14 (1991) 1605<

75、/p><p>　　[3] M. Horie, K. Saito, N. Nose, H. Nakazawa, J. Chromatogr. 538 (1991) 484.</p><p>　　[4] V. Hormazabal, M. Yndestad, J. Liq. Chromatogr. 17 (1994) 2911.</p><p>　　[5] J.R. Mei

76、nertz, V.K. Dawson, W.H. Gingerich, B. Cheng, M.M. Turbergen, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 77 (1994) 871.</p><p>　　[6] R.K. Munns, S.B. Turnipseed, A.P. Pfenning, J.E. Roybal, D.C. Holland, A.R. Long, S.M. Pla

77、kas, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 78 (1995) 343.</p><p>　　[7] S.M. Plakas, K.R. El Said, K.R. Bencsath, S.M. Musser, C.C. Walker, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 82 (1999) 614.</p><p>　　[8] J.A. Hernan

78、dez-Arteseros, R. Compano, M.D. Prat, Chromatographia 52 (2000) 58.</p><p>　　[9] V. Hormazabal, M. Yndestad, J. Liq. Chromatogr. 24 (2001)109.</p><p>　　[10] J.C. Yorke, P. Froc, J. Chromatogr. A

79、 882 (2000) 63.</p><p>　　[11] E. Chapuzet, N. Mercier, Stp Pharma Pratiques 7 (1997)169.</p><p>　　[12] B. Dele´pine, D. Hurtaud-Pessel, in: L.A. van Ginkel, A. Ruiter (Eds.), Proceedings of