冬蟲夏草菌子實體發(fā)育起始階段cDNA文庫的構建及ESTs分析.pdf

1、本文從冬蟲夏草分類地位、資源分布、形態(tài)特征、化學成分等幾個方面闡述了目前冬蟲夏草研究的概況，針對目前在冬蟲夏草研究中有性過程很少研究的情況，提出了研究冬蟲夏草子實體發(fā)育這一關鍵問題的必要性;此外，文章還詳細闡述了EST技術的原理、方法、及應用，從技術層面分析了本文研究方法的可行性與合理性。在此基礎上，明確了本研究的目的和意義，即通過系統(tǒng)的分子生物學的研究，揭示冬蟲夏草菌子實體發(fā)育啟動過程中關鍵功能基因及其代謝調控的規(guī)律，為進一步揭示其深

2、層次生物學奧秘奠定理論基礎。
　　研究利用實驗室建立的冬蟲夏草菌子實體人工培養(yǎng)技術體系，以分離自甘肅夏河縣扎油溝產冬蟲夏草的菌種為材料。分別在子實體發(fā)育啟動前和子實體原基發(fā)育啟動后取樣，用Hibind法提取總RNA，磁珠法分離mRNA，酶切改造克隆載體，SMART cDNA Library Construction Kit法構建cDNA文庫，在檢驗中間樣品和文庫合格后，挑選了文庫的數(shù)百個克隆進行測序，并將測得的序列進行深度分析，包

3、括:剔除污染序列，得到高質量的EST序列，通過序列聚類的方法將同一基因的EST序列聚類在一起，然后把聚類的數(shù)據(jù)進行序列拼接，得到一系列的單基因。然后，對上述單基因序列分別在NR和NT數(shù)據(jù)庫中做本地blast進行基因注釋;對未知基因進行開放閱讀框(ORF)的預測，并對預測的ORF在interpro數(shù)據(jù)庫中進行結構域和功能預測。用玉米赤霉作為背景，得到這些基因在生物過程，分子功能，細胞組件三個方面的聚類情況。此外將其與兩個文庫中的單基因高度

4、同源的基因作為KEGG數(shù)據(jù)庫的輸入進行代謝通路的注釋和分析。最后，以上述分析結果為基礎，比較了冬蟲夏草菌在子實體發(fā)育啟動前和啟動后基因表達上的差異。重點對有差異的關鍵基因的結構以及功能進行了深度分析。
　　結果顯示，本研究所獲得的總RNA，完整性好，純度高，由此分離的mRNA純度也合格。反轉錄的cDNA片段完整性好。進一步的全物種同源性序列比對分析表明，現(xiàn)有的序列與赤球叢赤殼，玉蜀黍赤霉和小麥冠腐病菌等同源性比較高。對沒有任何同源

5、序列的單基因進行開放閱讀框預測，兩個文庫中各找了6條和5條編碼蛋白，它們中大部分都含有顯著的信號肽結構域或者跨膜結構。
　　對兩個文庫序列的同源基因進行GO和代謝網絡分析，結果表明，這些基因無論在產物的分子功能、生物過程還是生物代謝通路中，都發(fā)揮著重要的作用。KEGG中，無論文庫1和文庫2都在核小體結構功能，電子傳遞鏈等代謝等通路上富集。
　　分析發(fā)現(xiàn)，在冬蟲夏草菌子實體發(fā)育啟動過程中，有VeA基因和HSP70基因的特異表達