黃河鯉性別特異片段的鑒定與性能差異cDNA文庫的構(gòu)建及相關(guān)ESTS功能分析.pdf

1、本研究以黃河鯉為實(shí)驗(yàn)材料,選擇220條10bp的隨機(jī)引物、10對SSR引物及100條ISSR引物,利用RAPD-PCR、SSR-PCR及ISSR-PCR三種分子標(biāo)記技術(shù)對黃河鯉基因組進(jìn)行掃描,試圖發(fā)現(xiàn)一些與黃河鯉性別相關(guān)的連鎖標(biāo)記。SSR結(jié)果顯示,雖然在對其DNA池進(jìn)行掃描的過程中,在1對引物的擴(kuò)增譜帶上發(fā)現(xiàn)了1條可能與性別連鎖的疑似條帶,但當(dāng)利用這對引物在更多的個體中驗(yàn)證時,沒有發(fā)現(xiàn)其性別特異性;而ISSR結(jié)果表明,在所有篩選出來的1

2、0條引物的擴(kuò)增譜帶上,未發(fā)現(xiàn)與性別連鎖的疑似條帶。
　　 利用RAPD技術(shù)對黃河鯉雌、雄基因池進(jìn)行掃描的結(jié)果表明,其中的5條隨機(jī)引物的擴(kuò)增譜帶中有疑似性別特異條帶的存在,利用這5條隨機(jī)引物在個體中進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證,只有隨機(jī)引物S2107的擴(kuò)增產(chǎn)物中存在一條穩(wěn)定的雄性特異條帶。經(jīng)回收、克隆、測序后獲得了一條大小為909bp的候選雄性特異條帶,命名為Ccmfl。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)該片段與位于斑馬魚連鎖群1的一段重復(fù)序列(DKEY-24

3、H22)有一定的相似性。
　　 此外,本研究還利用抑制性消減雜交技術(shù),成功構(gòu)建了黃河鯉魚基因組DNA的消減文庫,隨機(jī)挑選150個克隆經(jīng)巢式引物PCR驗(yàn)證后,獲得88個陽性克隆,以正、反向二次PCR產(chǎn)物為探針,與88個陽性克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行Southern dot blotting雜交,從中挑選了22個候選性別特異陽性克隆進(jìn)行序列測定,經(jīng)特異引物的PCR驗(yàn)證后,獲得了兩個長度分別為387bp和183bp雄性特異的DNA片段,BLA

4、STN和BLASTX檢索未發(fā)現(xiàn)與其同源的核苷酸和氨基酸序列,將其命名為Ccmf2和Ccmf3。
　　 根據(jù)3個雄性特異片段的序列分別設(shè)計特異引物,以管家基因GAPDH為內(nèi)部對照,雌雄個體基因組為模板進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,在所有的雄性個體中均擴(kuò)增出了穩(wěn)定的目的特異性條帶,而雌性個體中沒有該條帶的出現(xiàn)。由于分離到的三個片段都與雄性性別連鎖,所以推測黃河鯉的染色體類型應(yīng)該為XX/XY型。
　　 為了進(jìn)一步了解三個片段的

5、性別特異性,利用特異PCR技術(shù)對100個黃河鯉的雌、雄基因組進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cemf1和Cemf2的性別特異性分別為99％和98％;Ccmf3的性別特異性達(dá)到了100％,故3個雄性特異片段在兩染色體(性染色體和常染色體)間的重組值都很低,可以用于黃河鯉的遺傳性別的鑒別。
　　 分別以Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3為探針,與鯉魚的其他三個品種:野生黃河鯉、建鯉以及豐鯉的基因組進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交(雌、雄各5尾),以期判斷這3

6、個性別特異片段的分子性別有效性(即雌雄鑒別的效率)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在雌性個體中,Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3的分子性別有效性分別為67％,80％和93％;而在雄性個體中,其分子性別有效性分別為67％,100％,和73％。充分說明在鯉魚不同種間性染色體的分子類型的多樣性。3個雄性連鎖標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)與鑒定,能夠作為鑒別黃河鯉遺傳性別以及識別該魚種性染色體的分子切入點(diǎn),從而為探討該物種性別決定及分化機(jī)制提供依據(jù)。
　　 為了更加全面的了

7、解黃河鯉性腺發(fā)育機(jī)制,本研究還從mRNA水平上,分別以精巢與卵巢互為驗(yàn)證方,成功構(gòu)建了黃河鯉成熟期雌、雄性腺的雙向差減文庫,經(jīng)菌液PCR對文庫進(jìn)行初步篩選,分別獲得了280個(來自雄性文庫)和240個(來自雌性文庫)含有插入片段的陽性克隆;然后利用Southern dot bltting對隨機(jī)挑選的180個克隆(雌、雄各90個)在正、反雜交膜上進(jìn)行了鑒定,從中找到了64個(其中來自雄性文庫21個,雌性文庫43個)候選差異表達(dá)克隆,經(jīng)序列

8、測定后,通過BLASTN和BLASTX對這些候選差異基因片段進(jìn)行功能分類,得到了50個ESTS序列。其中雄性文庫的18個差異ESTS中,包括14個已知功能的和4個未知功能的基因片段。按照其功能,14個ESTS分屬于結(jié)構(gòu)蛋白基因、蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制相關(guān)基因、離子通道和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)基因、腫瘤相關(guān)和腫瘤抑制因子及其他基因等;而來自雌性文庫的32個差異ESTS代表了27個已知功能基因和5個未知功能的基因,在已知功能基因中,出現(xiàn)頻率較高的是來自呼吸鏈上的

9、相關(guān)基因片段,以及與蛋白合成有關(guān)的基因片段;除一些未知功能蛋白外,其他的則出現(xiàn)了1次。參照斑馬魚及其他脊椎動物基因功能分析,雌性文庫中已知功能EST分屬調(diào)節(jié)因子、結(jié)構(gòu)蛋白、酶類、轉(zhuǎn)錄因子、信號調(diào)控等。
　　 根據(jù)部分同源基因在黃河鯉精、卵巢中的半定量表達(dá)情況,在雄性差異文庫中找到10個差異表達(dá)基因片段:5個為精巢特異表達(dá)基因;5個為精巢高效表達(dá)基因;其中包括2個首次發(fā)現(xiàn)的未知功能基因。在雌性差異文庫中找到8個差異表達(dá)基因片段:2

10、個為卵巢特異表達(dá)基因;6個為卵巢高效表達(dá)基因,其中包括1個未知功能基因。
　　 根據(jù)各基因片段的性質(zhì)及編碼功能,選擇了可能參與性腺發(fā)育的3個基因片段,利用RACE技術(shù)對其全長進(jìn)行了擴(kuò)增,分別獲得了大小為2173bp、1763bp以及884bp的全長基因,他們分別是Hmwtla基因、HmSetd6基因以及HmPsmb2基因。最后,通過在成體不同組織的半定量和熒光定量表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)這3個基因均為性腺差異表達(dá)基因,其中Hmwtla

11、基因主要在精巢中表達(dá),HmSetd6基因則主要在卵巢中表達(dá),且表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精巢,而HmPsmb2基因則是卵巢特異表達(dá)基因;通過與脊椎動物性腺發(fā)育相關(guān)基因功能的對比,推測Hmwtla基因可能是黃河鯉雄性性別發(fā)育的重要調(diào)控基因;Hmsetd6基因則作為表觀調(diào)控基因參與了黃河鯉雌性性狀的發(fā)育;而HmPsmb2基因是在生理上或行為上維持黃河鯉雌性性別的性別偏向基因;這些基因的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)性腺差異表達(dá)EST文庫的構(gòu)建,將對了解黃河鯉性腺發(fā)育及性別