家兔Oct4-EGFP報(bào)告系統(tǒng)的建立.pdf

1、家兔繁殖周期短、經(jīng)濟(jì)成本低、體型適中、便于操作，其生理特征和系統(tǒng)發(fā)育方面比嚙齒類動(dòng)物更接近靈長(zhǎng)類，兼顧大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為一種重要的生物醫(yī)學(xué)和動(dòng)物發(fā)育機(jī)制研究模型。在很多情況下通過(guò)基因修飾的方法生產(chǎn)的動(dòng)物模型能更真實(shí)地模擬人類疾病的發(fā)病機(jī)制，其中胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCells，ESCs)結(jié)合嵌合體技術(shù)是獲得基因定點(diǎn)修飾動(dòng)物的一種很有效的方法。然而具有生殖系嵌合能力的家兔ESCs系還未建立，這成為獲

2、得基因修飾兔的主要障礙。轉(zhuǎn)錄因子Oct-4(POU5fl)作為一種重要的多能性標(biāo)記因子，特異性表達(dá)于ESCs、原始生殖細(xì)胞(primordialgermcells，PGCs)等多能性細(xì)胞中，它在ESCs的多能性維持方面以及體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程中起著至關(guān)重要的作用。利用Oct-4基因5‘端上游的調(diào)控區(qū)控制增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的表達(dá)，建立Oct4-EGFP報(bào)告系統(tǒng)，可

3、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)源Oct-4基因的表達(dá)，在研究多能性細(xì)胞的分化、體細(xì)胞的重編程方面有很重要的作用。目前，小鼠、人和豬的Oct4-EGFP報(bào)告系統(tǒng)已經(jīng)成功建立，并得到極為廣泛地應(yīng)用，但在家兔上卻未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)中我們從家兔基因組中擴(kuò)增出Oct-4基因的5’-端上游的調(diào)控區(qū)，并構(gòu)建含有Oct4-EGFP表達(dá)框的載體(pROP-EGFP);然后通過(guò)電穿孔的方法將載體導(dǎo)入家兔胚胎成纖維細(xì)胞(rabbitfetalfibroblasts

4、，RFF)，獲得穩(wěn)定整合Oct4-EGFP的轉(zhuǎn)基因RFF系，并以該細(xì)胞系進(jìn)行體細(xì)胞核移植;隨后將一部分核移植胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，另一部分核移植胚胎移到3只代孕受體中進(jìn)行體內(nèi)發(fā)育。核移植胚胎體外發(fā)育至囊胚，我們選擇表達(dá)EGFP的囊胚進(jìn)行抗Oct-4的胚胎免疫熒光染色，結(jié)果顯示Oct-4與EGFP在時(shí)空性表達(dá)上是一致的;核移植胚胎體內(nèi)發(fā)育至15天時(shí)，我們從2只懷孕的代孕受體母兔解剖分別獲得一枚胎兒。從胎兒中分離的生殖脊（含有原始生殖細(xì)胞）在倒