香魚c9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液的篩選【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　香魚C9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液的篩選</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄<

3、/b></p><p><b>　　1前言1</b></p><p>　　2實驗材料與方法2</p><p>　　2.1 原料、儀器和試劑2</p><p>　　2.1.1 原料與試劑2</p><p>　　2.1.2主要儀器3</p><p>　　2.1.

4、3主要試劑及其配制3</p><p><b>　　2.2實驗方法4</b></p><p>　　2.2.1誘導(dǎo)表達(dá)4</p><p>　　2.2.2菌體破碎5</p><p>　　2.2.3電泳檢測目的蛋白是否為包涵體5</p><p>　　2.2.4 染色與脫色5</p>

5、<p>　　2.2.5包涵體洗滌5</p><p>　　2.2.6電泳檢測5</p><p><b>　　3 結(jié)果6</b></p><p>　　3.1 菌株誘導(dǎo)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果6</p><p>　　3. 2 重組蛋白質(zhì)是否為包涵體的檢測結(jié)果7</p><p>　　3.3

6、 C9重組蛋白質(zhì)包涵體洗滌效果檢測結(jié)果7</p><p><b>　　4 討論8</b></p><p>　　4.1 包涵體洗滌劑效果分析9</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p>　　摘要：魚類

7、的補(bǔ)體在機(jī)體抵御致病微生物感染中起重要作用，該系統(tǒng)能夠激活溶血途徑和免疫調(diào)理作用來實現(xiàn)其對機(jī)體各種病害的防御功能，其中C9是構(gòu)成補(bǔ)體重要結(jié)構(gòu)之一末端補(bǔ)體分子的一類分子；為了制備香魚C9抗血清，以在香魚養(yǎng)殖中提高香魚免疫力減少病害造成的損失，利用基因重組技術(shù)，將重組蛋白純化變性等處理即得到抗血清。本實驗研究目的：鑒定目的蛋白為包涵體，并分析篩選純化包涵體較優(yōu)的洗滌緩沖液配方。研究方法：使用不同配方的洗滌液純化目的蛋白，通過SDS-PAGE

8、電泳分析各配方效果優(yōu)劣。結(jié)果：驗證了香魚C9重組蛋白是以包涵體形式存在，在對配方組成及結(jié)果分析中，篩選得到的最適香魚C9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液配方為PBS pH 8.0 + 0.5%Triton-X100 + 4M尿素洗滌C9包涵體1 h。</p><p>　　關(guān)鍵詞：包涵體；洗滌純化；補(bǔ)體；C9基因</p><p>　　Abstract: Complement system pla

9、ys an important role in killing microorganisms and in the centor of fish immune system. The system functions as a defense against diseases by activating the immune hemolytic pathway and immunoregulating. C9 is an one of

10、the important elements of a terminal complement molecules. Ayu is of great economic value. The history of ayu farming in China is short. The disease control technology and experience are not mature. The diseases in the c

11、ulture process has a serious </p><p>　　Keywords: Inclusion body; Washing and purification; Complement; C9 gene</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　香魚(Plecoglossus altivelis)，是溯

12、河性一年生的一種小型經(jīng)濟(jì)魚類。因它的脊背上有一條充滿香脂的腔道，能夠散發(fā)出香味，所以被稱為香魚。世界上的香魚已經(jīng)很稀少，只有在我國的閩南、臺灣局部地區(qū)仍存在豐富的資源。香魚的肉質(zhì)醇厚、細(xì)嫩味美并帶有殊香，就像從香水里撈出來一樣，并且也無其他魚腥味，人們對它評價很高很是喜愛，所以香魚養(yǎng)殖具有很大的經(jīng)濟(jì)價值和效益，如現(xiàn)市場鮮魚價已高達(dá)160-180元/kg，而“色如黃金，可攜千里”的香魚干，其價格已高達(dá)650元/kg [1]。但是香魚的養(yǎng)殖

13、歷史卻比較短，香魚的疾病防治技術(shù)和經(jīng)驗均還不成熟，在香魚養(yǎng)殖過程中，香魚疾病問題已嚴(yán)重影響了香魚養(yǎng)殖業(yè)更好的發(fā)展。在日本還有我國臺灣，常有香魚養(yǎng)殖病害的報道，尤其弧菌類疾病的發(fā)病率較高[2]。所以隨著養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們意識到必須加強(qiáng)病害防治及香魚疫苗方面的研究。目前日本已成功地研制出假單孢菌病的疫苗，已使得香魚的成活率高達(dá)82%3]。近年來，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)逐步完善的條件下，魚類免疫學(xué)和免疫防病技術(shù)引

14、起了人們的極大重視，即通過免疫手段特異性或非特異性作用來增強(qiáng)水</p><p>　　地球上的生物都在經(jīng)歷上億年的時間和不斷變化的自然環(huán)境的過程中，慢慢的形成了它們自身特有的防御體系——免疫系統(tǒng)。動物的免疫系統(tǒng)是由先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)兩部分組成[5]。其中魚類是脊椎動物中，種類數(shù)量占比重最多的一個類群，在進(jìn)化過程中，魚類是處于連接高等脊椎動物和低等無脊椎動物的一個特殊地位，但目前關(guān)于非特異性免疫因子以及其與高

15、等脊椎動物的比較研究還很有限，還缺乏更多的分子生物學(xué)方面的證據(jù)。對魚類免疫系統(tǒng)的深入研究，在一定程度上有助于進(jìn)一步的了解到脊椎動物免疫系統(tǒng)的發(fā)生、進(jìn)化以及其多樣性。和高等脊椎動物一樣，魚類也是利用免疫系統(tǒng)來初步防御外來病原生物的侵害，其免疫抵御機(jī)制包括非特異性免疫和特異性免疫，它們的共同作用是都能夠維持機(jī)體的正常功能以及魚類自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。</p><p>　　補(bǔ)體(Complement，C)是在先天免疫防御中

16、具有重要功能的體液分子，其被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后，能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生、抗體的形成以及介導(dǎo)病原體的清除 [6, 7]。補(bǔ)體的組成：它是由血漿補(bǔ)體成分、可溶性和膜型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白以及各種補(bǔ)體受體等30余種糖蛋白組成，是一個具備精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)[8]。其中補(bǔ)體的重要結(jié)構(gòu)之一末端補(bǔ)體分子膜攻擊復(fù)合體(MAC)：MAC是在細(xì)胞膜上形成許多親水性穿膜孔道，能夠使得水和電解質(zhì)通過，但不讓蛋白質(zhì)類等大分子逸出，最終因為細(xì)

17、胞內(nèi)的滲透壓改變，而使得細(xì)胞溶解破壞。MAC在細(xì)胞免疫中有重要作用，如創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可激活補(bǔ)體，可使膜攻擊復(fù)合物(C5b-9/MAC)形成并沉積，這對細(xì)胞病勢漸退和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的亞溶解有重要作用[9]。C6、C7、C8和C9是構(gòu)成膜攻擊復(fù)合物中引起靶細(xì)胞溶解破壞的重要組成成分。其中C9分子為形成MAC的最后一個分子，它是一種單鏈糖蛋白[10]，分子量是79kd。C9作為MAC重要組成之一，目前主要有應(yīng)用于一些相關(guān)疾病的檢測。近年

18、來，補(bǔ)體的應(yīng)用在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域和分子克隆技術(shù)日漸廣泛，魚類補(bǔ)體的生物學(xué)</p><p>　　在多種重組基因已在原核表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)的過程中，一部分的重組蛋白多以沒有生物活性的形式即包涵體的形式存在，而包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時，形成了一些由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在包涵體中除了包含大量的重組蛋白，也含有一些菌體成分，如一些核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白

19、、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，還有脂體、脂多糖等，大小為0.5～1μm，它們具有很高的密度(約為1.3mg/ mL) ，無定形，呈非水溶性。當(dāng)重組蛋白以包涵體的形式存在時，能夠獲得高表達(dá)、高純度的重組蛋白，去除了幾乎全部的細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)[14]，同時 ，因形成包涵體避免了蛋白水解酶對表達(dá)產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率[15,16]，通常其表達(dá)量可占菌體總蛋白的 10 %～30 %，甚至高達(dá) 50 %[17]，但包涵體不具有生物活性，需要通過體

20、外重折疊技術(shù)使包涵體復(fù)性才能恢復(fù)其天然構(gòu)象并表現(xiàn)出生物活性[18]。</p><p>　　包涵體形成的原因主要有以下幾種：(1)重組蛋白表達(dá)量過高 ，以往研究發(fā)現(xiàn)在重組蛋白低表達(dá)時很少形成包涵體，表達(dá)量越高就越容易形成包涵體[19]。其原因可能是由于合成速度太快 ，以至于沒有足夠的時間對重組蛋白進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，致使蛋白質(zhì)沒辦法達(dá)到足夠的溶解度等。(2)所需的目的重組蛋白是大

21、腸桿菌的異源蛋白，真核糖蛋白無法糖基化致使中間體溶解度下降，導(dǎo)致不溶解包涵體形成[20]。(3)重組蛋白分泌序列的存在阻礙其進(jìn)行折疊，導(dǎo)致有錯誤折疊的分子產(chǎn)生。(4)重組蛋白的氨基酸組成中，通常其含硫氨基酸越多就越容易形成包涵體。(5)從包涵體形成動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，包涵體是由部分變性的中間體聚合而成。因此，任何能夠影響到中間體穩(wěn)定性的因素，如 pH值(pH接近重組蛋白等電點(diǎn)時容易形成包涵體)、離子強(qiáng)度和溫度都能夠引起蛋白聚合反應(yīng)。(6)在

22、細(xì)菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、 疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。(7)有報道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體[21]。</p><p>　　本論文選擇香魚補(bǔ)體C9蛋白作為研究對象，通過利用大腸桿菌對C9重組蛋白的大量表達(dá)，在對C9重組蛋白包涵體進(jìn)行提取純化過程中，利用SDS-PAGE電泳檢測分析篩選出最適的洗滌液配方，以便為后續(xù)分析其蛋白功能關(guān)系及

23、C9抗血清制備奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2實驗材料與方法</b></p><p>　　2.1 原料、儀器和試劑 </p><p>　　2.1.1 原料與試

24、劑 </p><p><b>　　(1)菌株：</b></p><p>　　(2)質(zhì)粒： </p><p>　　(3)主要化學(xué)試劑：</p>

25、;<p>　　2.1.2主要儀器 </p><p>　　2.1.3主要試劑及其配制</p><p>　　(1) 菌體培養(yǎng)及保存所用試劑 </p><p>　　(a) LB液體培養(yǎng)基

26、：NaCl 0.5%，酵母抽提物0.5%，胰蛋白胨1%，用NaOH調(diào)pH至7.4，在151bf∕in(1.034x105)高壓蒸汽中滅菌20min。 </p><p>　　(b) LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂至

27、1.5%，高壓滅菌。</p><p>　　(c) 20%甘油：加20mL甘油于適量水中，加水定容至100mL過壓滅菌后于4℃保存，備用。</p><p>　　(d) IPTG保存液(100mM):500mg IPTG溶于20mL蒸餾水，用濾膜進(jìn)行無菌過濾，分裝保存于-20℃。 </p><p>　　(e) 卡那霉素注射液：硫酸卡那霉素360mg和甲氧芐啶18mg，

28、蒸餾水定容至2mL。</p><p>　　(2) 2×SDS-PAGE上樣緩沖液：50mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，100mmol/L DTT，2%SDS，0.01%溴酚藍(lán)，20%甘油，配制20mL。</p><p><b>　　(3) 洗滌液配方</b></p><p>　　(a) PBS洗滌液：300mM KCl

29、，稱取KCl 11.185g； 50mM KH2PO4，稱取KH2PO4 3.4g，加入容量瓶中，用蒸餾水定容500 mL，攪拌充分溶解，用KOH和HCl調(diào)節(jié)pH至8.0；</p><p>　　(b) PBS-1(PBS pH 8.0+2%脫氧膽酸鈉)：加0.05g 脫氧膽酸鈉于50mLPBS洗滌液中；</p><p>　　(c) PBS-2(PBS pH 8.0+0.5%Triton-X

30、100)：加250μL Triton-X100于50 mLPBS洗滌液中；</p><p>　　(d) PBS-3(PBS pH 8.0+0.5%Triton-X100+4M尿素)：加250μL Triton-X100和12g 尿素于50mLPBS洗滌液中；</p><p>　　(e) PBS-4(PBS pH 8.0+0.5% Triton-X100+4M 尿素+2%脫氧膽酸鈉)：加25

31、0μLTriton-X100、12g 尿素和0.05g 脫氧膽酸鈉于50mL PBS洗滌液中。</p><p>　　(4) SDS-PAGE凝膠電泳所用試劑

32、 </p><p>　　(a) 30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N’－亞甲丙烯酰胺1g，溶于60mL水中，定容至100mL，濾紙過濾后使用。</p><p>　　(b) 5xTris-甘氨酸電泳緩沖液：15.1g Tris堿，44g甘氨酸，5g SDS，加水至1000mL。</p><p>　　(c) 1.5mmol∕L Tris-Cl(pH8.8)：在

33、800mL水中溶解186.71gTris，調(diào)pH8.8，定容至1000mL。 </p><p>　　(d) 0.5mmol∕L Tris-Cl(pH6.8)：在800mL水中溶解121.14gTris，調(diào)pH6.8，定容至1000mL。

34、 </p><p>　　(e) 10%SDS：900mL水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容至1L，分裝備用。 </p><p>　　(f) 10%過硫酸銨：稱取過

35、硫酸銨2g，適量水溶解后，定容于至20mL，分裝成1mL∕管，-20℃保存?zhèn)溆谩?</p><p>　　(g) TEMED：4℃避光保存。

36、 </p><p>　　(h) 脫色液：45%甲醇，45%水，10%冰乙酸。 </p><p>　　(i) 考馬斯亮藍(lán)染液：脫色液中加考馬斯亮藍(lán)R－250或G－250至0.25%，濾紙過濾后使用。

37、 </p><p>　　(j) 2×SDS凝膠加樣緩沖液：Tris-HCl(0.5M，pH6.8，2.5mL)，SDS(0.4g)，甘油(2mL)，β-巰基乙醇或DTT(0.2mL)，溴酚藍(lán)(1%). </p><p><b>　　2.2實驗方法</b></p><p>&

38、lt;b>　　2.2.1誘導(dǎo)表達(dá)</b></p><p>　　挑取單個pET-28a-C9/BL21 pLys E菌落，涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)14h。在過夜培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)基中挑取單個菌落接種于5mL LB培養(yǎng)液(含50μg/mL卡那霉素)，37℃搖床培養(yǎng)過夜。取1mL過夜培養(yǎng)的LB培養(yǎng)液，按1:100比例稀釋，接種于100mL LB培養(yǎng)液(含50μg/mL卡那

39、霉素)中，2h后，取1mL作為對照，記作樣品1。其余培養(yǎng)液中加入IPTG(終濃度為0.4mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。</p><p><b>　　2.2.2菌體破碎</b></p><p>　　將含有構(gòu)建的表達(dá)載體的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)至100mL，在6000rpm下離心10min，棄上清，所得沉淀分別用20mL PBS洗滌液重懸浮，進(jìn)行超聲破碎(2s，間隔2s，90次)兩

40、次，破碎液中取樣100μL，記作樣品2；其余破碎液13，000rpm離心10min，取100μL的上清液，記作樣品3，取100μL的沉淀，記作樣品4，其余的上清和樣品冷藏保存。</p><p>　　2.2.3電泳檢測目的蛋白是否為包涵體</p><p>　　將樣品1-4加入 2×SDS-PAGE上樣緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH 6.8，100mmol/L DT

41、T，2%SDS，0.01%溴酚藍(lán)，20%甘油)，煮沸5min，10000rpm離心10min后，取上清20μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用未誘導(dǎo)的菌體蛋白和BL21 pLys E菌體蛋白作對照，進(jìn)行電泳。樣品在進(jìn)入分離膠前用80V，進(jìn)入分離膠后加至95V。</p><p>　　2.2.4 染色與脫色</p><p>　　電泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝膠，切去濃縮膠，同時切一角作為方向標(biāo)記，接

42、著用蒸餾水沖洗。用考馬斯亮藍(lán)R-250(0.25% Coomassie’s bright blue R-250)染色，室溫下，染色2h后轉(zhuǎn)至脫色液中脫色，脫色1h后用清水漂洗至凝膠背景無顏色，蛋白條帶清晰，再進(jìn)行觀察、攝像。</p><p>　　2.2.5包涵體洗滌</p><p>　　將含有包涵體超聲波破碎離心液沉淀用PBS重懸浮后，分成四份，每份10mL，分別用10mL四種不同PBS洗

43、滌液洗滌沉淀。13，000rpm 10min ，去上清后，采用PBS-1(含2%脫氧膽酸鈉)洗滌沉淀，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分別取樣200μL，記作樣品5-1、5-2、5-3。沉淀用PBS-2(含0.5%Triton-X100)洗滌，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分別取樣200μL，記作樣品6-1、6-2、6-3。13，000rpm ，離心10min，去上清，沉淀用PBS-3(含0.5%Triton

44、-X100+4M 尿素)洗滌，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分別取樣200μL，記作樣品7-1、7-2、7-3。13，000rpm ，離心10min，去上清，沉淀用PBS-4(含0.5%triton X-100+4M 尿素+2%脫氧膽酸鈉)洗滌，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分別取樣200μL，記作樣品8-1、8-2、8-3。</p><p><b>　　2.2.6電泳檢測&

45、lt;/b></p><p>　　樣品5-8，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，10000g離10min后，取上清20μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，37℃染色2h后轉(zhuǎn)至脫色液，脫色至蛋白條帶清晰，于純化前樣品2和樣品4做比較。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 菌株誘導(dǎo)蛋白

46、表達(dá)檢測結(jié)果</p><p>　　按上述實驗方法進(jìn)行操作，pET-28a-C9/BL21 pLys E菌落通過擴(kuò)大培養(yǎng)，然后使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，可見一條特異的清晰條帶(圖1中2號泳道)，已知C9蛋白的分子量是65.6KDa，與低分子量蛋白質(zhì)Mark做比對，可得圖1中2號泳道即為C9蛋白，所以誘導(dǎo)的菌株成功表達(dá)了C9蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。</p><p>　　圖

47、1：香魚C9目的蛋白SDS-PAGE 鑒定</p><p>　　Fig.1. Ayu C9 Identification of protein SDS-PAGE</p><p>　　M: 低分子量蛋白質(zhì)Marker(31.0KDa，43.0 KDa，66.2 KDa，97.4 KDa)</p><p>　　1：對照組-未誘導(dǎo)菌株 2：實驗組-IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

48、菌株培養(yǎng)液</p><p>　　3. 2 重組蛋白質(zhì)是否為包涵體的檢測結(jié)果</p><p>　　因為是微生物細(xì)胞組織中密度最大的結(jié)構(gòu)，所有的包涵體密度一般比較大，所以預(yù)測如果重組蛋白質(zhì)為包涵體，菌體超聲波經(jīng)破碎離心后，重組C9蛋白質(zhì)應(yīng)該存在于破碎液液離心的沉淀中，在圖2中4號泳道上可見一條特異的清晰條帶，與低分子量蛋白質(zhì)Mark做比對，需要純化的C9蛋白為包涵體在4號泳道中，即存在于菌體破

49、碎液的沉淀中，所以原核表達(dá)的C9重組蛋白為包涵體，與預(yù)期結(jié)果一致。</p><p><b>　　圖2：包涵體檢測</b></p><p>　　Fig.2 Detection of inclusion bodies</p><p>　　M: 低分子量蛋白質(zhì)Marker；3：破碎菌體上清；4：破碎菌體沉淀</p><p>　

50、　3.3 C9重組蛋白質(zhì)包涵體洗滌效果檢測結(jié)果</p><p>　　將C9重組蛋白質(zhì)包涵體分成四份后，經(jīng)四種不同配方PBS洗滌緩沖液洗滌不同時間的效果如圖3所示，結(jié)果顯示，四種配方洗滌效果優(yōu)劣順序為：7≈8>5>6，即PBS pH 8.0+0.5%Triton-X100+4M 尿素和PBS pH 8.0+2%脫氧膽酸鈉+0.5%Triton-X100+4M 尿素配方效果比較顯著，洗滌時間效果優(yōu)劣效果順

51、序為：5號和6號泳道顯示結(jié)果為3 h>2 h>1 h，但在7、8號泳道中時間影響并不顯著?？紤]到實驗快捷成本因素，綜合最佳配方與最佳洗滌時間，實驗C9重組蛋白質(zhì)包涵體最優(yōu)洗滌方案應(yīng)該是3號PBS緩沖液：PBS pH 8.0 +0.5%Triton-X100+4M 尿素洗滌C9包涵體1h。</p><p>　　圖3：C9重組蛋白包涵體洗滌效果檢測</p><p>　　Fig.3

52、 C9 detection of recombinant protein inclusion bodies washing effect</p><p>　　M: 低分子量蛋白質(zhì)Marker；</p><p>　　5：用PBS-1( PBS pH 8.0+2%脫氧膽酸鈉)洗滌液洗滌結(jié)果檢測；</p><p>　　6：用PBS-2( PBS pH 8.0+0.5%Tr

53、iton-X100)洗滌液洗滌結(jié)果檢測；</p><p>　　7：用PBS-3( PBS pH 8.0+0.5%Triton-X100+4M 尿素)洗滌液洗滌結(jié)果檢測；</p><p>　　8：用PBS-4( PBS pH 8.0+2%脫氧膽酸鈉+0.5%Triton-X100+4M 尿素)洗滌液洗滌結(jié)果檢測；</p><p>　　1：洗滌1h取樣；2：洗滌2h取樣

54、；3：洗滌3h取樣.</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　通過以往的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)的有利因素有：(1)可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)比較容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解；(2)降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高；(3)包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，

55、有利于分離純化；(4)對機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。包涵體的形成對重組蛋白不利的一面是在溶解包涵體進(jìn)行復(fù)性折疊的過程中需要加變性劑和去垢劑，而引起蛋白質(zhì)的不可逆修飾以及性質(zhì)改變，這些試劑價格昂貴，且復(fù)性的操作過程不好控制；另一方面復(fù)性過程常伴有蛋白質(zhì)水解和沉淀，有些還形成異構(gòu)體[22]。</p><p>　　包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的分離、洗滌、溶解、純化及復(fù)性

56、。在實驗室操作中，為了減少包涵體在上柱純化和制備抗血清過程中雜質(zhì)蛋白的影響，對包涵體的前處理即包涵體洗滌是很重要的。目前的一些研究以及實驗室常用的洗滌液通常是含有低濃度的變性劑，表面活性劑，還原劑，EDTA[23]，使用的還原劑一般為0.1-5mM，EDTA為0.1-0.3 mM。一般通過這些洗滌劑對包涵體進(jìn)行清洗后，可以得到比較純的包涵體。</p><p>　　4.1 包涵體洗滌劑效果分析</p>

57、<p>　　為了純化包涵體蛋白，需要除去粘附在包涵體上各種的雜質(zhì)，如菌體膜蛋白、脂質(zhì)、核酸等，常用的純化方法有離子交換色譜法、凝膠過濾法、嗜硫色譜法、親和色譜法、疏水作用色譜法等，為了減少包涵體在上柱純化過程中的上柱操作步驟和各種雜質(zhì)的影響，通常會將包涵體用洗滌液進(jìn)行洗滌，常用的洗滌劑有低濃度的變性劑如尿素或鹽酸胍、去垢劑脫氧膽酸鈉或者活性劑Triton X-100等。根據(jù)以往實驗佐證以及查閱文獻(xiàn)了解到鹽酸胍是一種比尿素強(qiáng)的

58、變性劑，使用過程中它能打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，而且其價格較高，一般用于后續(xù)包涵體處理中的包涵體的溶解，所以本實驗中選取的三種包涵體洗滌劑：脫氧膽酸鈉、Triton-X100和尿素進(jìn)行組合篩選，實驗室常用的組合為PBS-1、PBS-2 、PBS-3、 PBS-4。以上三種洗滌劑在包涵體洗滌過程中的原理和效果各不相同。脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，SDC）是一種能與胰蛋白酶和質(zhì)譜分析兼容的變性劑，通

59、常它被用在蛋白質(zhì)的溶解和分析，SDC是一種離子型的去垢劑，能夠相當(dāng)有效的溶解和變性蛋白，但是它最大的缺點(diǎn)就是會明顯影響酶活性和干擾肽段的色譜分離</p><p>　　包涵體經(jīng)過有效的洗滌后，減少了重組蛋白表達(dá)形成包涵體時其中所含的雜質(zhì)，本次實驗由于時間原因沒有繼續(xù)檢測洗滌純化得到包涵體的純度，如果洗滌的包涵體達(dá)到一定純度，即可經(jīng)過簡單處理后制備成抗血清，用于進(jìn)一步的實驗研究，此外，該步驟在重組蛋白純化過程中也是尤

60、為重要的一步，洗滌中清除掉雜蛋白、核酸、脂質(zhì)等，能夠減少后續(xù)的蛋白變性、復(fù)性特別是上柱操作中雜質(zhì)的影響，特別是上柱操作，如果雜質(zhì)較多，會造成柱純化次數(shù)多等問題，影響實驗結(jié)果和實驗時間、材料。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 李明云, 丁天喜, 竺俊全等. 我國香魚的研究現(xiàn)狀及增養(yǎng)殖前景[J]. 寧波大學(xué)學(xué)報(理工版), 199

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