重組腸激酶包涵體的復(fù)性、純化及其新型重組子的構(gòu)建.pdf

1、腸激酶（enterokinase，EK）是一種以異源二聚體形式存在于哺乳動物十二指腸內(nèi)的絲氨酸蛋白酶，可沿胰蛋白酶原序列中（Asp）4-Lys的羧基端切下，從而釋放出活性胰蛋白酶。正是腸激酶在體內(nèi)表現(xiàn)出的這種高度的酶切特異性使其成為當(dāng)前基因工程領(lǐng)域融合蛋白表達(dá)后切割與純化的重要工具之一。較之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、輕胺等化學(xué)試劑，腸激酶具有非特異性切割少，反應(yīng)條件寬泛，切割位點在全部識別序列之后，切出的目

2、標(biāo)產(chǎn)品首位氨基酸可完全忠實于天然蛋白等特點。近年來所做的嘗試多是克隆與表達(dá)235個氨基酸的具有酶學(xué)活性的腸激酶輕鏈（EKL）。 本論文的第一部分是對本實驗室已構(gòu)建好的工程菌pET39b-EKL/BL21（DE3）的蛋白表達(dá)、純化進(jìn)行研究。先確定了誘導(dǎo)條件：37℃下培養(yǎng)菌體，OD600為0.7時開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6小時，IPTG終濃度為0.5mmol/L。隨后對培養(yǎng)液上清中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行親和分離純化，產(chǎn)量為每100毫升原發(fā)酵液中純化后

3、的目標(biāo)蛋白腸激酶量為43.65μg，純化收率8.34％。由于上清液中腸激酶收率不高，本文又對腸激酶包涵體進(jìn)行變性復(fù)性、純化研究。采用變性上柱、柱上復(fù)性方式進(jìn)行鎳離子親和分離純化，利用產(chǎn)物N段攜帶8個相連的組氨酸與金屬螯合層析介質(zhì)中的鎳離子的親和性，應(yīng)用Ni-NTA金屬螯和層析對樣品包涵體進(jìn)行純化分離。實驗結(jié)果表明，在變性條件下純化的樣品在柱上不經(jīng)洗脫，直接用復(fù)性液洗滌，可以使腸激酶在得到提純的同時實現(xiàn)復(fù)性。最后優(yōu)化復(fù)性條件，提高收率。經(jīng)

4、測定包涵體復(fù)性后產(chǎn)量可達(dá)到470μg，純化收率可達(dá)到20.3％。 第二部分，本論文開創(chuàng)了另一種利用腸激酶蛋白的新思路--構(gòu)建雙質(zhì)粒系統(tǒng)，讓目的融合蛋白在體系中不需要再單獨加入腸激酶蛋白就可進(jìn)行融合蛋白的切割。并針對現(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)中融合蛋白有以包涵體形式和可溶分泌表達(dá)形式兩種情況，對雙質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行了初步的構(gòu)建。構(gòu)建了一個復(fù)制子與大多商業(yè)化質(zhì)粒不相同，拷貝數(shù)低，不影響目的蛋白大量表達(dá)的重組子-pSB3K3-EKL。將EKL基因插入到