疏水作用層析及其滲透質(zhì)輔助包涵體蛋白質(zhì)復性的研究.pdf

1、包涵體蛋白質(zhì)體外折疊復性是基因工程下游的瓶頸之一，采用傳統(tǒng)的稀釋復性方法復性包涵體蛋白質(zhì)容易形成聚集體和錯配體，復性后的蛋白質(zhì)很難在高濃度下得到高活性回收率。本論文的目的在于利用疏水作用層析技術開發(fā)一種新的疏水作用層析輔助包涵體蛋白質(zhì)復性方法，實現(xiàn)蛋白質(zhì)在高濃度下的高活性和高回收率。 本論文分為四個部分。第一部分對復合干擾素的稀釋復性條件及復性方法進行了優(yōu)化，考察了聚乙二醇、甘油等滲透質(zhì)以及 Butyl FF、Phenyl FF

2、、PorosET 和 Poros PE 等疏水層析介質(zhì)作為添加劑對復合干擾素稀釋復性的影響，總結出 Poros ET/10％ PEG 混合體系為最佳，復性蛋白收率為 74.6％，比活為2.61×10<'8>U/mg，分別高于對照組的 45.4％和2.1×10<'8>U/mg。 第二部分應用反相高效液相層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、氧化型/還原型SDS-PAGE電泳以及質(zhì)譜二硫鍵定位等方法對稀釋復性復合干擾素的各構型體進行分析

3、，建立了反相高效液相層析方法檢測復合干擾素錯配體、可溶聚集體和活性體(正確折疊體)模型。 第三部分為復合干擾素的疏水作用層析復性研究。直接采用蛋白質(zhì)分離純化用的商業(yè)疏水作用層析方法不能有效地輔助蛋白質(zhì)正確折疊，導致較低的活性收率和不可逆性吸附；在流動相中添加恒定濃度的滲透質(zhì)聚乙二醇和應用一過性高濃度鹽酸胍洗脫，一方面可以避免不可逆性吸附，另一方面可以抑制聚集體的產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)回收率達到70％以上，但由于形成了較高比例的錯配體，使

4、蛋白活性不高，并且復性效果明顯受到上樣量的限制使復性蛋白質(zhì)濃度偏低。論文的一個主要貢獻是根據(jù)疏水作用層析的特點，發(fā)展了一種新型的梯度增高聚乙二醇濃度和梯度降低鹽酸胍濃度的雙梯度疏水作用層析復性包涵體蛋白質(zhì)的方法。應用現(xiàn)代的層析工作軟件很容易完成各種濃度梯度的洗脫策略，這種梯度增高聚乙二醇濃度和梯度降低鹽酸胍濃度的雙梯度疏水層析輔助復性模式顯示出優(yōu)越性，可以獲得高蛋白質(zhì)濃度下的高比活性和高蛋白回收率。吸附于層析柱上的變性復合干擾素在周圍溶

5、液不斷而溫和變化的復性環(huán)境中逐漸被正確折疊和洗脫下來。對于各種影響因素如：鹽酸胍初濃度、鹽酸胍濃度梯度、聚乙二醇終濃度、聚乙二醇濃度梯度和梯度洗脫流速也進行了考察。采用優(yōu)化的復性條件可以獲得蛋白質(zhì)收率為 84％，蛋白質(zhì)比活為 7.9×10<'8>U/mg，蛋白質(zhì)濃度為620 ug/ml 的復合干擾素，實現(xiàn)了包涵體變性蛋白質(zhì)在高濃度下的高效復性。 論文的第四部分為粒細胞集落刺激因子的疏水色譜復性研究。首先考察了甘油、吐溫和聚乙二醇

6、不同滲透質(zhì)對粒細胞集落刺激因子稀釋復性的影響，發(fā)現(xiàn)在稀釋復性緩沖液中加入適當比例(15％)的甘油能夠使蛋白回收率由25.4％提高到31.5％。利用雙梯度疏水層析復性模式，建立了另一個包涵體蛋白質(zhì)復性方法，即梯度增高甘油濃度和梯度降低鹽酸胍濃度的雙梯度疏水層析輔助復性。應用該復性方法對粒細胞集落刺激因子包涵體蛋白質(zhì)進行復性展示出優(yōu)越性。采用優(yōu)化后的甘油終濃度、甘油濃度梯度、鹽酸胍初濃度、鹽酸胍濃度梯度和梯度洗脫流速等復性條件可以獲得蛋白濃