牛皮膠原蛋白酶解條件優(yōu)化【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　牛皮膠原蛋白酶解條件優(yōu)化</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學與工程

2、 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p&g

3、t;<p><b>　　1. 前言3</b></p><p>　　2. 材料與方法3</p><p>　　2.1 材料與儀器3</p><p>　　2.1.1 材料3</p><p>　　2.1.2 主要儀器和設備4</p><p><b>　　2.2方法4&l

4、t;/b></p><p>　　2.2.1測定方法4</p><p>　　2.2.1.1酶活力的測定4</p><p>　　2.2.2.2水解度的測定4</p><p>　　2.2.2 試驗方法5</p><p>　　2.2.2.1 酶解用酶種類的選擇5</p><p>　　2.

5、2.2.2 酶解工藝優(yōu)化5</p><p><b>　　3 結果與討論5</b></p><p>　　3.1 蛋白酶活力的測定5</p><p>　　3.2 酶解用酶的選擇6</p><p>　　3.3 木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的工藝條件優(yōu)化7</p><p>　　3.3.1木瓜蛋白酶

6、酶解牛皮膠原蛋白的單因素試驗7</p><p>　　3.3.1.1 酶解溫度的確定7</p><p>　　3.3.1.2 酶解pH的選擇7</p><p>　　3.3.1.3 酶解時間的選擇8</p><p>　　3.3.1.4 木瓜蛋白酶加酶量的選擇9</p><p>　　3.3.2 木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原

7、蛋白的正交試驗9</p><p>　　3.4 復合酶酶解工藝優(yōu)化10</p><p>　　3.4.1 復合蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的單因素試驗11</p><p>　　3.4.1.1 加酶量的選擇11</p><p>　　3.4.1.2 pH值的選擇11</p><p>　　3.4.1.3 酶解溫度的選擇12

8、</p><p>　　3.4.1.4 酶解時間的選擇12</p><p>　　3.4.2 復合酶酶解牛皮膠原蛋白正交試驗13</p><p><b>　　4 結論14</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻14</b>

9、;</p><p>　　摘要：本文研究了酶解法提取牛皮膠原蛋白小分子肽的工藝條件。以牛皮膠原蛋白的水解度作為指標，分別研究木瓜蛋白酶和復合蛋白酶對牛皮膠原蛋白的酶解效果，通過采用單因素試驗和正交試驗得到優(yōu)化的工藝條件。正交試驗表明，兩種酶分別酶解時，酶解時間、溫度、pH值、加酶量對牛皮膠原蛋白水解度的影響順序均為：溫度>pH值>加酶量>時間；木瓜蛋白酶酶解的優(yōu)化條件是溫度55。C、ph值6.5、

10、時間6h、加酶量6000U/g，在該優(yōu)化條件下牛皮膠原蛋白的水解度可以達到23.1%；復合蛋白酶酶解的優(yōu)化條件是：溫度55。C、時間8h、pH值8.0、加酶量8000U/g，在該優(yōu)化條件下牛皮膠原蛋白的水解度可以達到35.9% 。復合蛋白酶的對牛皮膠原蛋白的酶解效果優(yōu)于木瓜蛋白酶。</p><p>　　關鍵詞：膠原蛋白；膠原肽；酶解法；水解度</p><p>　　Abstract: Thi

11、s essay studies on the extraction conditions of cowhide collagen small peptides using enzymatic method. Using degree of hydrolysis of cowhide collagen as indicators, study the enzymatic effect caused by papain and comple

12、x protease respectively and then derive optimized conditions by single factor experiment and orthogonal experiment. Orthogonal experiment shows that when two enzymes working respectively, the order of influence caused by

13、 enzymolysis time、temperature、pH nalue and addi</p><p>　　Keywords: Collagen; Collagen peptide; Enzymatic; Degree of hydrolysis</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　我國是皮革生產(chǎn)大國之一，每年

14、生產(chǎn)30萬噸以上的皮革廢渣，利用這些工業(yè)廢棄物酶解來制備膠原多肽，使其變廢為寶，不僅減少環(huán)境污染，還能帶來良好的社會效益和經(jīng)濟效益。但是由于酶自身的缺點，如高度的底物專一性，易變敏感性，水解率偏低等，導致工業(yè)化生產(chǎn)的成本較高，產(chǎn)品價格昂貴。所以尋找熱穩(wěn)定性好的膠原蛋白酶，改進各種水解工藝條件，提高膠原蛋白酶解為膠原多肽的酶解效率，將成為水解膠原蛋白領域的研究重點[1]。</p><p>　　由于膠原多肽具有良好的

15、營養(yǎng)功能、理化性能以及生理功能，所以它的應用范圍非常廣泛。隨著年齡的增長，人體對能量的需求量呈下降趨勢，但單位體重氮的需求量并不下降，老年人可通過攝入膠原多肽來克服這一矛盾[2-5]。由于膠原多肽具有保護胃粘膜抗?jié)?、抑制血壓上升、提高骨骼強度、促進皮膚膠原代謝等功能，同時酶解膠原蛋白制備的膠原多肽具有更小的相對分子質量, 并且更易降解, 所以在營養(yǎng)保健品和日用化學品開發(fā)方面擁有一定的市場，可將其開發(fā)成各種美容護膚品、美容飲料或降血壓、

16、預防骨質疏松等的功能保健品[6-7]。除此之外膠原多肽還可應用于運動保健食品中，實驗證明: 由于膚在胃中排空及小腸吸收快，負氮平衡及由此產(chǎn)生的肌肉分解代謝階段將進一步縮短或消失，膠原水解物可作為在運動或運動結束時的恢復性飲料[7-10]。由于蛋白水解物屬于高蛋白低熱量物質，還可應用于減肥食品。</p><p>　　膠原蛋白是一類結構相關的蛋白質家族，廣泛存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，是結締組

17、織極其主要的結構蛋白，起著支持結構器官、保護機體的作用[10-14]。膠原蛋白具有獨特的三股超螺旋結構，三條鏈相互平行而且由鏈間氫鍵相連，具有十分穩(wěn)定的性質，一般的加工溫度及短時間加熱都難使其分解，因此難被人體吸收，食用利用率較低[15-19] 。將膠原蛋白水解為膠原多肽后，其營養(yǎng)及生理功能可顯著提高：蛋白質消化吸收率幾乎達100％，能保護胃黏膜以及抗?jié)?，促進皮膚膠原代謝，抑制血壓上升，對關節(jié)炎等膠原病具有很好的預防及治療作用，能促進

18、鈣吸收和降低血清中膽固醇含量等 。因此，膠原蛋白的水解及膠原多肽的利用一直是一個熱門課題[20]。本文主要介紹了酶解條件（溫度、pH、酶解時間、加酶量）對膠原蛋白水解度的影響，以及研究木瓜蛋白酶和復合蛋白酶對牛皮膠原蛋白酶解的最優(yōu)條件，從而得到有較高水解度的酶解用酶和酶解條件[21]。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>

19、　　2.1 材料與儀器</b></p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　牛皮膠原溶液：以新鮮牛皮為原料、對牛皮進行去脂、去雜，以0.5mol/L的乙酸為提取介質，采用胃蛋白酶酶解，提取液經(jīng)過過濾初步分離得。</p><p>　　胃蛋白酶 生物試劑 上海源聚生物科技有限

20、公司</p><p>　　木瓜蛋白酶 生物試劑 上海源聚生物科技有限公司</p><p>　　胰蛋白酶 生物試劑 上海源聚生物科技有限公司</p><p>　　復合蛋白酶 生物試劑 廣西東恒華道生物科技有限公司</p><p>　　氫氧化鈉

21、 分析純 國藥試劑</p><p>　　干酪素 化學試劑 廣東醫(yī)藥站化學試劑綜合公司</p><p>　　乙醇 分析純 國藥試劑</p><p>　　其它均為實驗室常規(guī)試劑</p><p>　　2.1.2 主要儀器和設備</p&g

22、t;<p>　　DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司</p><p>　　TDL-5臺式低速大容量離心機 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠</p><p>　　分光光度計 北京普析通用儀器有限公司</p><p>　　PHS-

23、25型數(shù)顯pH計 上海精密科學有限公司</p><p>　　其它為實驗室常用設備</p><p><b>　　2.2方法</b></p><p><b>　　2.2.1測定方法</b></p><p>　　2.2.1.1酶活力的測定</p>

24、<p>　　福林-酚法，按照SB/T10317-1999測定</p><p>　　2.2.2.2水解度的測定</p><p>　　水解度（DH）的定義：在水解過程中降解的肽鍵占蛋白質肽鍵總數(shù)的百分比。當?shù)鞍踪|全部水解生成游離氨基酸時，DH=100%； 未水解時，DH=0%[22]。</p><p>　　甲醛定位滴定法，測定原理：甲醛固定氨基的堿性，使羧基顯

25、示出酸性，用酸度計對電位的變化進行定量測定，根據(jù)pH值判斷和控制滴定終點。</p><p><b>　　操作步驟：</b></p><p>　　將酶解液在4000r/min下離心10min，吸取5ml上層清置于100ml容量瓶中，加蒸餾水至標線吸取20.0ml 上述溶液于燒杯中，加60ml蒸餾水，1%酚酞指示劑0.2ml；用0.1M 氫氧化鈉標準液滴定至剛顯微紅色pH

26、值約8.2記錄消耗氫氧化鈉的體積V1；</p><p>　　2.加入5.0ml 37%中性甲醛溶液（甲醛溶液先用氫氧化鈉滴定至8.2），混勻。再用0.1M氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)滴定至深紅色ph值約8.5記錄消耗氫氧化鈉的體積 V2；</p><p>　　3.另取一不加入蛋白酶，其它條件完全一樣，作為對照試驗；</p><p>　　2.2.2 試驗方法</p>

27、;<p>　　2.2.2.1 酶解用酶種類的選擇</p><p>　　選取復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，按每克膠原溶液選擇相同的酶活力單位，在各自最適的酶解條件下進行酶解，以水解度為主要指標，確定兩種比較適宜的水解用酶對膠原蛋白進行酶解。</p><p>　　2.2.2.2 酶解工藝優(yōu)化</p><p>　　對選定的兩種用酶先進行單因素試

28、驗研究，以水解度為主要指標。分別參考加酶量、溫度、ph值、時間對水解度的影響。再在單因素試驗的基礎上選擇通過正交試驗的方法，以水解度DH為指標，優(yōu)化酶解條件。</p><p><b>　　3 結果與討論</b></p><p>　　3.1 蛋白酶活力的測定</p><p>　　按照SB/T10317-1999的方法，繪制酪氨酸標準曲線，結果如圖

29、3.1所示。</p><p>　　Fig 3.1 Tyrosine standard curve</p><p>　　以每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1µg酪氨酸為1個蛋白酶活力單位，測定樣品吸光值，再通過圖3.1 標準曲線上找出相應的酪氨酸濃度，最后計算出蛋白酶活力，實驗測得所選用的幾種蛋白酶活力測定的結果見表3.1所示。</p><p>　　表3.1 蛋白酶活

30、力的測定結果</p><p>　　Tab 3.1 The measured results of protease vigor</p><p>　　3.2 酶解用酶的選擇</p><p>　　參照各種酶的使用說明書。分別在選擇的幾種酶的適宜條件下酶解2h，以水解度為主要指標，確定最適的水解用酶。其中膠原濃度料液比選擇1：20，濃度太大的話會形成粘稠的膠原粘液，不利

31、于酶解的進行。因此本文所有的酶解底物濃度均為1：20，不再對底物濃度進行單獨分析。水解度的測定按照甲醛定位滴定法，結果見表3.2所示。</p><p>　　表3.2 不同酶對牛皮膠原的酶解效果</p><p>　　Tab3.2 Different enzymes collagen enzyme solution of cowhide effect</p><p>

32、　　從表3.2中可以看出，三種酶對牛皮膠原的水解效果為：復合蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的要明顯高于胰蛋白酶和胃蛋白酶。其中復合蛋白酶跟木瓜蛋白酶水解效果要明顯高于另外兩種酶。復合蛋白酶一般由枯草桿菌深層液體發(fā)酵產(chǎn)生，經(jīng)濃縮提取精制復合而成，是一種桿菌蛋白酶的復合體。此外，也有根據(jù)生產(chǎn)或研究直接對蛋白酶進行復配而成的復合酶。復合酶與其它單一的酶比較，其組成成分更為復雜，酶切位點也更多，因而其對

33、底物的適應性要更強。木瓜蛋白酶一般由種植的番木瓜未成熟果實中割取乳液經(jīng)采用生物技術提取、微濾、超濾、冷凍干燥提煉而得。木瓜蛋白酶具有較強的蛋白酶水解能力，還還具有凝乳、解脂和溶菌活力，是一種能作用于各類蛋白質的純天然產(chǎn)物。并且具有耐高溫、活性強、穩(wěn)定性好、蛋白質水解能力強等特性，此外對pH變化不是很敏感，因此應用比較廣泛。從本試驗結果來看，木瓜蛋白酶對牛皮膠原的作用也比較強，其中水解度DH=13.2，高于胰蛋白酶和胃蛋白酶。根據(jù)實驗結果

34、綜合考慮，本實驗選擇木瓜蛋白酶和復合蛋白酶作為牛皮膠原酶解的水解用酶。</p><p>　　3.3 木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的工藝條件優(yōu)化</p><p>　　3.3.1木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的單因素試驗</p><p>　　3.3.1.1 酶解溫度的確定</p><p>　　分別用五個三角瓶各取100ml牛皮膠原溶液，調節(jié)初始pH至6

35、.0，酶用量為4000u/g，在溫度分別為45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下，提取4h測定其水解度，考察溫度對木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原的影響。實驗結果見圖3.1.1.1所示</p><p>　　Fig 3.1.1.1 The influence of temperature on hydrolysis degree</p><p>　　溫度對酶解反映的影響比較復雜，不但能影響水解反

36、應的速度，還能直接影響酶的活力。從圖1中可知，當水解溫度低于55℃時，隨溫度的增加牛皮膠原的水解程度增加；當在55℃和60℃之間時水解程度變化不是很明顯；當大于60℃時，水解度反而有所下降；分析可能是溫度升高導致木瓜蛋白酶活力降低。在55℃時候，木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原有較高的水解度。</p><p>　　3.3.1.2 酶解pH的選擇</p><p>　　分別用五個三角瓶各取100ml牛皮

37、膠原溶液，加酶量為4000U/g 、溫度60℃的條件下水解4h ，調節(jié)初始pH值分別為4.5 、5.0 、5.5 、6.0 及6.5，考察pH值對水解度的影響。結果見表2所示</p><p>　　Fig 2 The influence of pH on hydrolysis degree</p><p>　　pH值得大小直接影響酶的活力，每一種酶都有其適宜的pH值范圍。從圖2可知，當pH

38、值小于6.0 時，水解度隨pH值的升高而增加；當pH值大于6.0 時，水解度隨pH值的升高而降低；pH值為6.0 時，水解度較高。表明木瓜蛋白酶在pH值6.0 時的弱酸性條件下對牛皮膠原蛋白的水解達到了一個較好的效果，在酸或過堿的環(huán)境下，木瓜蛋白么酶的活性會受到不同程度的抑制，此外，不適宜的pH環(huán)境還會影響酶與底物的結合，也會影響水解效果。因此選擇pH=6.0為木瓜蛋白酶水解牛皮膠原的酶解pH值。</p><p>

39、;　　3.3.1.3 酶解時間的選擇</p><p>　　分別用五個三角瓶各取100ml牛皮膠原溶液，溫度60℃ ，初始pH值為6.0 ，加酶量4000U/g ，酶解時間分別取 2h、4h、6h、8h和10h，考察不同酶解時間對水解度的影響。結果見表3所示</p><p>　　Fig 3 The influence of time on hydrolysis degree</p>

40、;<p>　　一般蛋白質水解的水解度會隨著作用時間的增加而增加；但是當達到一定的時間后，隨底物濃度的下降、水解產(chǎn)物的積累，水解度增加的程度會不再增加。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中為提高經(jīng)濟效益，常常選擇此時作為酶解作用時間。由圖3可知，時間在6h內，隨時間的延長，水解程度也不斷的增加，但是當超過6h時，隨著時間的延長，酶解程度幾乎不再增加，在木瓜蛋白酶降解牛皮膠原蛋白時，宜選用6h作為酶解的作用時間。</p><

41、p>　　3.3.1.4 木瓜蛋白酶加酶量的選擇</p><p>　　分別用五個三角瓶各取100ml牛皮膠原溶液，在前面幾個單因素實驗的基礎上，選擇pH=6.0 、溫度60℃的條件下水解4h ，以每克底物的酶用量分別為2000U/g 、4000U/g 、6000U/g 、8000U/g 、10000U/g 考察加酶量對水解度的影響。結果如圖4所示</p><p>　　Fig 4 The

42、 influence of add enzyme quantity on hydrolysis degree</p><p>　　一般來說隨蛋白酶用量的增加蛋白質的水解程度也隨之增加；但是當水解到一定程度時，由于底物濃度的下降，蛋白質的水解度不會一直隨酶用量的增加而增加。如圖4所示，當木瓜蛋白酶酶用量6000U/g 時，就可達到較好的水解效果。此后在增加用酶量水解度幾乎不再變化。因此，木瓜蛋白酶加酶量的選擇應不超

43、過6000U/g較為適宜。</p><p>　　3.3.2 木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的正交試驗</p><p>　　本實驗的目的是通過單因素試驗、正交試驗的方法，以期得到酶解牛皮膠原蛋白的最宜條件，以水解度為主要指標，確定木瓜蛋白酶用于牛皮膠原蛋白酶解工藝條件。因素水平表見表1 ，按L9（34）正交表進行正交試驗，正交試驗的結果見表2 。</p><p>　　表

44、1 正交試驗因素水平表</p><p>　　Tab 1 The factors and Levels of orthogonal experiment</p><p>　　表2 正交試驗結果與分析</p><p>　　Tab 2 The results analysis of orthogonal experiment</p><p>

45、;　　從表5.2可知，四個因素對牛皮膠原蛋白水解的影響順序為：溫度 > pH > 加酶量 >時間，優(yōu)化所得的工藝條件為：55℃、pH6.5、6000u/g、6h 。通過驗證實驗得，在該優(yōu)化條件下，牛皮膠原蛋白的水解度可達到23.1% 。</p><p>　　3.4 復合酶酶解工藝優(yōu)化</p><p>　　3.4.1 復合蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的單因素試驗</p>

46、;<p>　　3.4.1.1 加酶量的選擇</p><p>　　參照實驗所選用的復合酶說明書，在pH7.0、溫度55℃、酶解時間6h，研究不同加酶量對水解度的影響。其結果如圖5.</p><p>　　Fig5 The influence of add enzyme quantity on hydrolysis degree</p><p>　　從圖5可

47、知，加酶量在2000~80000U/g范圍內，隨著加酶量的增加牛皮膠原蛋白的水解度也逐漸增加，但當加酶量大于80000U/g時，加酶量增加，水解度反而有所下降。可能是酶濃度太大，反而阻礙了酶與底物的結合，影響水解效率。因此加酶量選擇應不超80000U/g。</p><p>　　3.4.1.2 pH值的選擇</p><p>　　加酶量為6000U/g，溫度55℃、時間6h，考察不同pH對復合

48、酶對牛皮膠原蛋白水解度的影響。結果見圖6</p><p>　　Fig 6 The influence of pH on hydrolysis degree</p><p>　　從圖6中可以看出，pH值對水解度的影響較大。pH的大小直接影響酶的活力。當pH值小于7.5時，隨pH的升高水解度增加，當pH值大于7.5時，隨pH的升高水解度降低，pH在7~8時，水解度較高。實驗結果表明復合酶pH

49、在7~8時對牛皮膠原蛋白的水解度效果較好，在過酸或國建的環(huán)境中，酶的活力會受到不同程度的影響，此外，不適宜的pH環(huán)境還會影響酶與底物的結合，影響水解效果。</p><p>　　3.4.1.3 酶解溫度的選擇</p><p>　　酶用量6000U/g，pH值7.0、時間6h，考察不同溫度對復合酶對牛皮膠原蛋白水解度的影響。結果見圖7</p><p>　　Fig 7 T

50、he influence of temperature on hydrolysis degree</p><p>　　從圖中可知，酶解溫度在50℃~60℃時，復合酶對牛皮膠原蛋白的水解度效果較好在55℃時候達到最大值。</p><p>　　3.4.1.4 酶解時間的選擇</p><p>　　加酶量6000U/g、pH為7.0、溫度55℃，考察酶解時間對牛皮膠原蛋白水

51、解度的影響。結果圖8所示</p><p>　　Fig 8 The influence of time on hydrolysis degree</p><p>　　從圖8可知，牛皮膠原蛋白的水解度隨著酶解時間的延長逐漸變大，當酶解8h后，達到最大值，此后延長酶解時間，水解度不再增加。</p><p>　　3.4.2 復合酶酶解牛皮膠原蛋白正交試驗</p>

52、;<p>　　與研究木瓜蛋白酶的方法一樣，以水解度問主要指標，通過正交試驗設計，確定復合蛋白酶用于牛皮膠原蛋白二步酶解工藝條件。按L9（34）正交表進行正交試驗，因素水平表和實驗結果分析表，分別見表1和2.</p><p>　　表 1 正交試驗因素水平表</p><p>　　Tab 1 The factors and Levels of orthogonal exper

53、iment</p><p>　　表 2 正交試驗結果與分析</p><p>　　Tab 2 The results analysis of orthogonal experiment</p><p>　　從表2可知，四個因素對牛皮膠原蛋白水解度影響順序為：溫度>pH>加酶量>酶解時間，所得優(yōu)化工藝條件為：溫度55℃、時間8h、pH為8、加酶量為

54、8000U/g。通過驗證實驗得在該優(yōu)化條件下，牛皮膠原蛋白的水解度可達到35.9%。</p><p><b>　　4 結論</b></p><p>　?。?）通過酶的選擇實驗，以牛皮膠原蛋白的水解度為主要指標，選擇了木瓜蛋白酶和復合蛋白酶作為酶解牛皮膠原蛋白的酶解用酶。 </p><p>　?。?）在單因素試驗的基礎上對兩種酶的酶解工藝進行了

55、優(yōu)化。正交試驗結果表明，木瓜蛋白酶酶解牛皮膠原蛋白的最適工藝條件為：溫度55℃、時間6h、pH為6.5、加酶量為6000U/g，通過驗證實驗，得到在該優(yōu)化條件下，牛皮膠原蛋白的水解度可達到23.1% 。復合蛋白酶通過優(yōu)化所得到工藝條件為：溫度55℃、時間8h、pH為8、加酶量為8000U/g，通過驗證實驗得，在該優(yōu)化條件下，牛皮膠原蛋白的水解度可以達到35.9% 。</p><p>　?。?）復合蛋白酶的酶解效果

56、要優(yōu)于木瓜蛋白酶。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 蔣挺大,張春萍.膠原蛋白[M].北京:化學工業(yè)出版社, 2001.</p><p>　　[2] 唐傳核,彭志英.一種新型功能性食品基料-膠原多肽[J].中國商辦工業(yè), 2001(5):44-45.</p><p>　　[3] 蔣

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