基于豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白及抗原表位的間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的病毒性傳染病。該病以妊娠母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙，新生及斷奶前仔豬高死亡率以及各年齡段尤其是仔豬的呼吸道疾病為特征。1987年該病第一

2、次在美國被發(fā)現(xiàn)，1991年在荷蘭分離到該病毒，1996年中國成功分離到了第一株P(guān)RRSV CH-1a株。目前該病流行于世界各養(yǎng)豬國家，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是威脅當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一。目前檢測PRRSV抗體的方法有很多，在臨床上主要是用ELISA的方法檢測，其中以N蛋白和GP5蛋白包被居多，在臨床上都有較高的符合率。本研究主要以純化的重組N蛋白和人工合成的兩個N蛋白抗原(P30和P32)表位做包被抗原，建立方法進(jìn)行臨

3、床樣本檢測，并和商品化試劑盒(IDEXX和LSI)進(jìn)行比較。
　　 主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.PRRSV ORF7基因的克隆與表達(dá)通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的PRRSV廣東湛江株提取RNA做為模板，擴(kuò)增ORF7基因，然后將擴(kuò)增出來的基因克隆連接到表達(dá)載體pET32a上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)并純化出重組的N蛋白，大小為33KDa，并對N蛋白進(jìn)行Western blot分析，證實(shí)其可以被PRRSV陽性血清

4、識別，具有抗原性。
　　 2.PRRSV間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用利用重組的N蛋白和人工合成的P30，P32等3個抗原，通過方陣滴定法確定最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)，并優(yōu)化其相關(guān)的反應(yīng)條件，建立了3種抗原的間接ELISA檢測方法，并與商品化試劑盒（IDEXX和LSI）進(jìn)行比較。通過已建立的重組N蛋白，P30，P32 ELISA方法檢測免疫豬群血清樣本，與IDEXX商品化試劑盒比較的臨床符合率分別為91.5％，88.3％，