蛹蟲草形成子實(shí)體表型差異的分子生物學(xué)研究.pdf

1、蛹蟲草(Cordyceps militaris(L．)Link)在我國(guó)又叫北冬蟲夏草，是一種能寄生多種鱗翅目昆蟲蛹及幼蟲的真菌。其在功能食品、醫(yī)藥和生物學(xué)技術(shù)等方面都具有很好的價(jià)值。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)上市的一些名為冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk．)Sacc)的藥品和功能食品，實(shí)際上大部分都是采用蛹蟲草生產(chǎn)的。人工培養(yǎng)蛹蟲草是解決野生蟲草來(lái)源不足的良好途徑，但是在人工培養(yǎng)蛹蟲草過(guò)程中，菌種退化現(xiàn)象嚴(yán)重是制約產(chǎn)業(yè)化開發(fā)

2、的一大瓶頸。到目前為止，國(guó)內(nèi)外針對(duì)蛹蟲草異核體與配型方面進(jìn)行系統(tǒng)的分子生物學(xué)研究鮮見報(bào)道，然而從這兩個(gè)方面的研究入手卻能在遺傳物質(zhì)差異水平上很好的揭示蛹蟲草退化本質(zhì)。 本研究中，實(shí)驗(yàn)第一部分，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的一優(yōu)勢(shì)蛹蟲草原始菌株(編號(hào)：WM04)進(jìn)行單孢子分離，共獲得22個(gè)單孢子分離株，采用米飯培養(yǎng)基培養(yǎng)確證，其中20個(gè)完全不產(chǎn)子實(shí)體，2個(gè)能產(chǎn)子實(shí)體；對(duì)6個(gè)完全不產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株、1個(gè)經(jīng)12次轉(zhuǎn)接后退化的菌株和原始菌株的菌落

3、形態(tài)特征和菌絲體生長(zhǎng)速率等方面進(jìn)行比較觀察，結(jié)果表明：不產(chǎn)子實(shí)體的單孢子分離株的菌落形態(tài)特征和菌絲生長(zhǎng)速率等方面特征不僅與原始菌株和轉(zhuǎn)接退化菌株都存在很大差異，并且它們彼此之間的差異也非常大。以上結(jié)果說(shuō)明蛹蟲草具有多型現(xiàn)象。 第二部分，對(duì)4個(gè)菌落形態(tài)典型的不產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株、1個(gè)產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株、1個(gè)經(jīng)12次轉(zhuǎn)接后退化的菌株和原始菌株，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)和核糖體RNA基因(rDNA)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(IT

4、S)序列分析；然后采用NTSYS-pc軟件對(duì)RAPDs圖譜構(gòu)建UPGMA聚類圖，采用PAUP<'*>4.0bata10軟件基于ITS序列構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。結(jié)果表明：所有實(shí)驗(yàn)菌株彼此之間RAPDs圖譜差異都很大，不產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株的RAPDs圖譜不僅與原始菌株和轉(zhuǎn)接退化菌株都存在很大的差異，并且在它們彼此之間的差異更大，原始優(yōu)勢(shì)對(duì)照菌株與轉(zhuǎn)接退化菌株之間的RAPDs圖譜差異卻相對(duì)較?。凰袑?shí)驗(yàn)菌株，彼此之間的ITS序列差異卻很小

5、。以上結(jié)果初步顯示蛹蟲草菌種退化現(xiàn)象嚴(yán)重的主要原因可能是由準(zhǔn)性生殖導(dǎo)致遺傳物質(zhì)嚴(yán)重改變?cè)斐傻摹?第三部分，設(shè)計(jì)MAT1-1-1、MAT1-2-1兩個(gè)高保守交配型基因的引物，摸索最適PCR反應(yīng)條件，對(duì)16個(gè)不產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株、2個(gè)產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株、1個(gè)經(jīng)12次轉(zhuǎn)接后退化的菌株和原始菌株進(jìn)行交配型和交配型基因方面的研究。結(jié)果表明所有不產(chǎn)子實(shí)體單孢子分離株具備的是單一配型，不是MAT1-1型就是MAT1-2型，而所有能產(chǎn)子實(shí)體