TGEV感染PK-15細胞的蛋白質組學及誘導炎癥反應的分子機制.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的以仔豬嚴重腹瀉、脫水、嘔吐為主要臨床特征的高度接觸性傳染病。該病最早于1946年在美國確認，目前已在多個國家廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。早期的報道顯示，TGEV作為一種腸道冠狀病毒，能夠誘導高水平的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，同時也引起腸

2、道組織的炎性損傷，鈉、鉀離子嚴重失衡，進而導致仔豬嚴重腹瀉脫水致死。這提示我們該病毒與宿主天然免疫應答密切相關，炎癥反應在其致病性方面扮演著十分重要的角色。然而，目前對該病毒如何介導天然免疫應答引起宿主細胞的信號轉導機制知之甚少。因此，本研究利用蛋白質組學技術分析了TGEV與宿主細胞蛋白之間的互作，并且對TGEV感染誘導炎癥反應的細胞信號轉導機制進行了研究。具體研究內容如下:
　　1.TGEV感染PK-15細胞的蛋白質組學研究為了

3、了解TGEV感染對宿主細胞蛋白表達的影響，利用同位素標記相對和絕對定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術，配合液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)，對TGEV感染PK-15細胞的蛋白表達情況進行了檢測和分析。共鑒定出162個差異表達的蛋白，包括60個表達上調的蛋白和102個表達下調的蛋白。隨后利用生物信息學技術對差異表達蛋白的亞細胞定位、生物學進

4、程聚類進行了分析，并繪制了互作網(wǎng)絡圖，發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白與細胞周期、細胞的生長與分化及天然免疫反應等多種生物進程相關。并且上調倍數(shù)位居前列的9個蛋白均與Ⅰ型干擾素信號通路(interferon signaling pathway)，尤其是信號轉導子和轉錄激活子1（signal transducer and activator of transcription1，STAT1）以及8種重要的干擾素刺激基因（interferon stimul

5、ated genes，ISGs）密切相關。為了驗證蛋白質組學結果的可靠性，進一步通過Western blot或Real-time RT-PCR方法對STAT1和8個ISG的表達進行了檢測，結果與蛋白質組學結果一致。為了確定TGEV感染是否激活JAK-STAT1信號通路，對TGEV感染后STAT1的磷酸化情況和亞細胞定位進行了檢測，結果TGEV感染PK-15細胞后能夠誘導STAT1的磷酸化和轉位入核，說明TGEV感染能激活JAK-STAT

6、1信號通路并誘導ISGs的產(chǎn)生。
　　2.TGEV感染激活NF-κB信號通路的分子機制NF-κB是調控促細胞炎癥因子、趨化因子產(chǎn)生的核心轉錄因子，在細胞的炎癥反應中扮演著十分重要的角色，本研究對TGEV感染激活NF-κB的信號轉導機制開展了研究。首先，利用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TGEV感染對NF-κB的激活情況，發(fā)現(xiàn)其能顯著增強NF-κB啟動子活性，且與病毒的復制密切相關。進一步發(fā)現(xiàn)TGEV感染能夠誘導IκBα的降解，以及

7、促進p65發(fā)生磷酸化和核轉移。為了確定NF-κB在TGEV誘導炎癥反應中的作用，我們使用NF-κB特異性活性抑制劑BAY11-7082處理細胞，結果抑制NF-κB活性后顯著下調TGEV誘導的IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES的表達，但不影響TGEV的復制。為了確定可能參與介導TGEV激活NF-κB信號通路的模式識別受體與接頭蛋白，利用RNA干擾技術分別沉默受體蛋白基因RIG-I、MDA5和接頭蛋白基因MAVS、STING的表達

8、，結果這幾個基因的沉默均能顯著抑制TGEV誘導的p65磷酸化和多種促炎癥細胞因子的表達，說明RLRs介導的信號通路參與TGEV激活NF-κB。
　　3.TGEV感染激活JNK信號通路誘導炎癥反應MAPK信號通路參與介導細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理病理進程，是機體重要的信號轉導系統(tǒng)。MAPK能被多種炎性刺激激活，又對炎癥反應的發(fā)生進行調控。因此，對TGEV感染影響MAPK通路進行研究有助于進一步全面了解TGEV誘導炎癥反應的

9、分子機制。首先，我們對TGEV感染是否激活MAPK通路進行了研究，結果顯示，TGEV在感染后不同時間點能夠誘導ERK1/2、JNK1/2、p38MAPK三種激酶發(fā)生磷酸化，并且雙熒光素酶實驗顯示TGEV能夠激活下游轉錄因子AP-1。為了進一步確定哪一條通路參與TGEV誘導促炎癥因子的產(chǎn)生，分別使用ERK、JNK、p38 MAPK的特異性抑制劑對細胞進行了處理，結果顯示當JNK1/2的激活受到抑制時能夠顯著降低TGEV誘導的IL-6、IL