龍眼胚性培養(yǎng)物胞質(zhì)型apx基因克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、本研究以龍眼(Dimocarpus longan Lour.)“紅核子”胚性愈傷組織(Embryogenic callus，EC)體胚發(fā)生同步化調(diào)控而獲取的各主要發(fā)育階段胚性培養(yǎng)物以及經(jīng)過NaCl、光、溫度等逆境脅迫處理的龍眼LC2胚性愈傷組織為材料，進(jìn)行如下研究：①在已有3'端序列基礎(chǔ)上，采用同源克隆技術(shù)克隆胞質(zhì)型apx基因5'端序列以獲得完整的ORF；②進(jìn)行胞質(zhì)型apx'基因的原核表達(dá)；③進(jìn)行龍眼胚性培養(yǎng)物APX活性測(cè)定；④建立龍眼

2、APX同工酶電泳分析方法，分析龍眼體胚發(fā)生過程各階段培養(yǎng)物以及逆境脅迫處理下龍眼EC的APX同工酶變化；⑤克隆龍眼胚性培養(yǎng)物中看家基因(β-actin)，利用熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過程各階段培養(yǎng)物以及逆境脅迫處理下龍眼EC胞質(zhì)型apx基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化。主要研究結(jié)果如下： 1.龍眼胚性愈傷組織胞質(zhì)型apx基因5'端序列克隆與cDNA全長序列獲得以龍眼EC為材料，采用5'RACE方法，在已經(jīng)獲得的3'序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)反

3、式引物，結(jié)合通用引物，進(jìn)行巢式PCR，經(jīng)過引物篩選和條件優(yōu)化得到500 bp左右的特異條帶。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該目的片段與已知3'序列有250bp左右的重合序列，將二者拼接，得到1027bp目的序列。該序列與登錄Genbank的其它植物胞質(zhì)型apx基因有很高的同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)拼接的cDNA含有一個(gè)753 bp的開放閱讀框，編碼251個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸序列與植物胞質(zhì)型APX高度同源。經(jīng)過分析，753 bp的開放閱讀框中不含有內(nèi)含子。

4、 2.龍眼胞質(zhì)型apx基因原核表達(dá)根據(jù)拼接得到龍眼apx全長cDNA的序列分析，在可能的ORF區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)添加限制性內(nèi)切酶的特異引物，進(jìn)行ORF片段擴(kuò)增并將其克隆到表達(dá)載體pET-29a中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中進(jìn)行融合表達(dá)。經(jīng)過誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)宿主菌中有一個(gè)分子量約為28 kD的新蛋白出現(xiàn)。該誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白分子量與理論推導(dǎo)龍眼胞質(zhì)型APX的分子量27.7 kD相符。 3.NaC

5、l、光和溫度脅迫下龍眼胚性愈傷組織APX酶活性變化在光、NaCl和溫度脅迫處理下，龍眼胚性愈傷組織中APX酶活性均存在明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，三種逆境脅迫都可不同程度的誘導(dǎo)APX活性增加：推測(cè)APX活性變化與胚性細(xì)胞抗逆性正相關(guān)。 4.龍眼體胚發(fā)生過程不同階段培養(yǎng)物和逆境脅迫處理下龍眼EC的APX同工酶變化本研究在APX同工酶提取、電泳、染色等幾個(gè)方面進(jìn)行了摸索，建立了一套適合分離龍眼胚性培養(yǎng)物APX同工酶的垂直板聚丙

6、烯酰胺凝膠電泳分析方法。并利用此方法分析龍眼體胚發(fā)生過程不同階段培養(yǎng)物和逆境脅迫處理下龍眼EC的APX同工酶變化。發(fā)現(xiàn)在龍眼體胚發(fā)生這一氧化脅迫過程中，APX同工酶隨胚性細(xì)胞分化會(huì)有酶譜帶消失和新增，不同發(fā)育階段存在明顯差異。在三種逆境脅迫處理下，龍眼EC中APX同工酶隨脅迫條件的不同也會(huì)有酶譜帶消失和新增。這些結(jié)果表明龍眼胚性細(xì)胞對(duì)氧化脅迫的應(yīng)答不是依靠一種APX酶單獨(dú)作用，而是多種APX同工酶一起協(xié)同作用。 5.龍眼胞質(zhì)型a

7、px基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析本研究從龍眼胚性愈傷組織中克隆到895 bp的β-actin基因3'端序列，做為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析胞質(zhì)型apx基因表達(dá)變化的參照。分析結(jié)果顯示，在龍眼體胚發(fā)生過程中，不同分化程度的胚性培養(yǎng)物的胞質(zhì)型apx基因在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量均較胚性愈傷組織高，在緊實(shí)球形結(jié)構(gòu)階段相對(duì)表達(dá)量最大，之后在球形胚和子葉形胚階段其相對(duì)表達(dá)量又有所降低。龍眼胚性愈傷組織溫度脅迫下的分析結(jié)果顯示，溫度脅迫可誘導(dǎo)胞質(zhì)型apx基因表