可剪切雜合抗病蛋白基因的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因柑橘潰瘍病抗性評價.pdf

1、柑桔潰瘍病是具有毀滅性危害的細(xì)菌性病害，給柑桔產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。植物基因工程育種具有周期短、可控性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗病基因?qū)敫探郏瑥亩嘤共∑贩N，成為柑桔抗病育種的重要方法。柑桔異源基因比如動物或昆蟲抗菌肽基因已被成功用于柑桔抗病基因工程育種中。然而，抗菌肽基因轉(zhuǎn)入植物后所遇到的主要問題就是抗菌肽表達(dá)豐度偏低，在植物細(xì)胞中不夠穩(wěn)定，容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，因而限制了抗菌肽功效的發(fā)揮。為了提高抗菌肽基因

2、抗柑桔潰瘍病能力，本研究利用可剪切連接肽將不同抗菌肽以及抗菌肽和人溶菌酶融合為一個編碼框，構(gòu)建可剪切雜合抗病蛋白基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其導(dǎo)入錦橙中，使抗病融合基因在錦橙中一次表達(dá)產(chǎn)生不同抗菌肽和溶菌酶，以期增強(qiáng)抗菌肽的殺菌效果，提高柑桔潰瘍病抗性。主要研究結(jié)果如下:
　　1.可剪切連接多肽2A和LP4在柑桔中指導(dǎo)目的蛋白剪切效率分析
　　為了評價連接多肽2A和LP4對雜合抗病基因翻譯后產(chǎn)物剪切的影響，以GFP和GUS為報告基

3、因構(gòu)建了GFP-2A-GUS和GFP-LP4-GUS雜合基因。構(gòu)建其超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入錦橙中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。提取轉(zhuǎn)基因植株葉片總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，連接多肽2A與LP4均能在轉(zhuǎn)基因錦橙中有效剪切雜合蛋白，但2A對融合蛋白的剪切效果明顯強(qiáng)于LP4。因此，在構(gòu)建融合基因用于轉(zhuǎn)化柑桔時，2A更適合作為連接多肽。
　　2.CB-2A-HL、CB-2A-AP6、CB-2A-AP5雜合抗病基因的構(gòu)建
　

4、　根據(jù)上述研究結(jié)果，以2A為連接多肽，將抗菌肽CecropinB(CB)、AP00355(AP5)、AP01065(AP6)及人溶菌酶(HL)融合，構(gòu)建了三個融合基因CB-2A-HL、CB-2A-AP6、CB-2A-AP5。其中，在CB基因的5'端引入胞外分泌信號肽AAT序列，在AP5、AP6以及HL基因的5'端引入胞外分泌信號肽PRla序列。
　　3.植物表達(dá)載體p35S∶CB-2A-HL、p35S∶CB-2A-AP6、p35S

5、∶CB-2A-AP5的構(gòu)建及柑桔的遺傳轉(zhuǎn)化
　　以植物表達(dá)載體pLGNL為骨架，構(gòu)建了CaMV35S啟動子分別調(diào)控CB-2A-HL、CB-2A-AP6、CB-2A-AP5基因表達(dá)的植物表達(dá)載體p35S∶CB-2A-HL、 p35∶CB-2A-AP6、p35S∶CB-2A-AP5。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這些植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入錦橙中，GUS組織化學(xué)染色和PCR分析鑒定轉(zhuǎn)基因植株。共獲得p35S∶CB-2A-HL轉(zhuǎn)基因植株36株，p35S∶C