油菜病毒株系鑒定和抗病相關(guān)基因研究及轉(zhuǎn)基因飄逸評(píng)價(jià).pdf

1、病毒病是影響油菜生產(chǎn)的主要病害，病害流行年份可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。油菜病毒有明顯的株系分化，株系間存在致病性差異；目前缺乏對(duì)病毒病高抗或免疫的油菜品種，病毒病抗病分子機(jī)制研究相對(duì)滯后，尚未找到關(guān)鍵抗病相關(guān)基因。因此開(kāi)展油菜功能基因組學(xué)研究，探明油菜抗病分子機(jī)制，獲得關(guān)鍵的功能基因，培育轉(zhuǎn)基因抗病毒新品種，是從根本上解決該病害防治問(wèn)題的有效途徑。另一方面，有關(guān)轉(zhuǎn)基因油菜中外源基因飄逸至鄰近非轉(zhuǎn)基因植株、近緣雜草或近緣野生種所帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)

2、，目前仍是人們最為關(guān)注的問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因油菜在我國(guó)雖然沒(méi)有商業(yè)化種植，但許多單位正在積極研究開(kāi)發(fā)，而且我國(guó)每年都從國(guó)外進(jìn)口大量轉(zhuǎn)基因油菜籽，所以轉(zhuǎn)基因的飄逸與環(huán)境安全性評(píng)估必不可少，但我國(guó)卻極少有相關(guān)的研究報(bào)道。 本研究在田間病害調(diào)查的基礎(chǔ)上，鑒定了13個(gè)油菜品種和14份油菜種質(zhì)資源材料對(duì)主要病毒TuMV的抗性，通過(guò)分析病毒分離物對(duì)油菜品種的致病力差異，進(jìn)而明確我國(guó)油菜主要病毒株系的變異情況。從本課題組構(gòu)建的油菜抗病性相關(guān)UniGe

3、ne庫(kù)中挑選3個(gè)抗病相關(guān)基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)研究，以明確這些基因的功能與抗病育種利用價(jià)值。研究了在我國(guó)自然環(huán)境條件下由花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因飄逸距離及其影響因素，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因油菜的商品化生產(chǎn)和安全管理提供科學(xué)依據(jù)。取得的主要研究結(jié)果如下： 1.明確了油菜病毒病的主要毒源及相關(guān)分離物的分類(lèi)歸屬。從湖北和安徽兩省12個(gè)縣市采集258份油菜病毒病害樣品，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)占病

4、害樣品總量的90.7％，黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMv)占8.9％，油菜花葉病毒(Youcaimosaicvirus，YoMV)占0.8％。在人工高病害壓接種條件下，對(duì)當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的13個(gè)油菜品種及14份資源材料進(jìn)行TuMV抗性鑒定的結(jié)果表明，參試的13個(gè)油菜品種均不抗TuMV，但感病性低于對(duì)照品種中油821；14份油菜資源材料間抗性差異顯著，有3份材料表現(xiàn)高抗和中抗。TuMV分離物對(duì)油菜品種的致病力測(cè)定

5、表明，TuMV分離物致病力無(wú)明顯的地域性差異，各地都存在致病力強(qiáng)弱不同的毒株。測(cè)序獲得了18個(gè)TuMV分離物的CP基因序列，序列同源性比較及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明，其中17個(gè)分離物與MB類(lèi)群代表分離物序列同源性在97％以上，均屬于MB類(lèi)群；蘿卜分離物WRS1與MR類(lèi)群代表分離物同源性在95.4％～98.7％之間，歸屬于MR類(lèi)群；另外一個(gè)蘿卜分離物WRS2在MB類(lèi)群中單獨(dú)形成一個(gè)分支，可能是2個(gè)類(lèi)群發(fā)生重組的后代。 2.明確了油菜上一

6、種桿狀病毒分離物屬YoMV的一個(gè)株系。在我國(guó)，侵染油菜的一種煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的桿狀病毒長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)。本研究對(duì)一個(gè)油菜的桿狀病毒分離物進(jìn)行生物學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)該病毒對(duì)十字花科作物致病力強(qiáng)，對(duì)茄科作物致病力弱，寄主范圍與TMV不同；提純病毒粒體呈短桿狀，平均大小約為295nm×15nm，與TMV極為相似；該病毒與TMV在血清學(xué)性質(zhì)上存

7、在明顯差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；對(duì)病毒3’末端2283bp序列分析發(fā)現(xiàn)，該病毒mp、cp和3’末端非編碼區(qū)(NCR)大小分別為798bp、474bp和235bp，mp和cp基因之間有77bp重疊序列。序列同源性比較和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明，該病毒與TMV同源性低于60％，與Tobamovirus屬中侵染十字花科病毒的同源性高于80％，其中與YoMV不同株系的同源性高于90％，因而將該分離物劃分為YoMV的一個(gè)株系。由于從武漢分離，故命名為YoMV

8、武漢株系(YoMV-Wh)，該研究為準(zhǔn)確劃分我國(guó)Tobamovirus屬油菜桿狀病毒的歸屬提供了依據(jù)。 3.構(gòu)建了3個(gè)抗病相關(guān)基因的植物過(guò)表達(dá)載體及RNAi載體，轉(zhuǎn)化油菜并獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。從本課題組構(gòu)建的油菜抗病性相關(guān)UniGene庫(kù)中挑選與主要抗病反應(yīng)途徑相關(guān)的3個(gè)基因BN1、BN5和BN10，并用5’-RACE法克隆出非全長(zhǎng)基因的全序列，分別構(gòu)建了各基因的植物過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體，通過(guò)花粉管通道法在授粉后8～12

9、h將表達(dá)載體導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜。經(jīng)過(guò)除草劑篩選、PCR檢測(cè)及Southernblot鑒定，確認(rèn)獲得3個(gè)基因的4株轉(zhuǎn)基因油菜，后代突變性狀觀察發(fā)現(xiàn)一株黃白花雄性不育突變體和一株黃白雙色花嵌合體。BN5基因RNAi載體T1代轉(zhuǎn)基因株系目標(biāo)基因熒光定量PCR分析表明：轉(zhuǎn)基因植株中BN5基因的表達(dá)受到抑制，但不同單株受抑制的程度不同，表達(dá)量最低的單株相對(duì)表達(dá)量?jī)H為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?0％。多數(shù)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株接種病毒后比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭鼮楦胁?，且?duì)CMV的

10、感病程度要高于YoMV和TuMV。由此可見(jiàn)，BN5基因具有天然的抗病毒功能，有重要的抗病育種利用價(jià)值。 4.首次報(bào)道了在我國(guó)環(huán)境條件下轉(zhuǎn)基因油菜花粉介導(dǎo)的基因飄逸距離及頻率。利用除草劑抗性基因bar作為標(biāo)記基因檢測(cè)花粉飄逸。研究結(jié)果表明：花粉飄逸的距離達(dá)2000m，且飄逸率隨著與花粉源區(qū)距離的增加而急劇減少。但在距花粉源區(qū)33.5m到2000m的范圍內(nèi)，花粉飄逸率均低于0.015％，并不隨距離增加而逐漸下降，表現(xiàn)了花粉長(zhǎng)距離飄逸