油菜素內(nèi)酯相關(guān)突變體和轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定及其效應(yīng)的初步分析.pdf

1、油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids，BR)是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的甾醇類植物激素，被稱為第六大植物激素。BR參與一系列生理生化反應(yīng)，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。目前在雙子葉模式植物擬南芥中已確立一條由細(xì)胞表面BR受體BRI1到細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子BZR1和BES1的較完整的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但在作為單子葉模式植物和重要作物的水稻中BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中很多重要元件還未被克隆，部分已克隆基因的生物學(xué)功能仍不明確。
　　本研究以

2、BR合成關(guān)鍵基因DWF4、BR受體蛋白基因D61、以及BR信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(BZR1～BZR4)等6個(gè)重要基因?yàn)閷?duì)象，一方面以相關(guān)基因的突變體為實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)創(chuàng)建BR關(guān)鍵基因的過表達(dá)和敲除材料，初步分析并探討調(diào)控BR合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)水稻株型、稻米外觀和食味品質(zhì)等的影響。相關(guān)研究與結(jié)果為深入解析BR功能、以及通過遺傳操作優(yōu)化BR途徑培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新品種提供了重要的材料基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、對(duì)收集的BR信號(hào)通路關(guān)鍵基因的

3、突變體bzr1、bzr4-1、bzr4-2、d61-1和d61-2進(jìn)行分子鑒定、表達(dá)分析、農(nóng)藝性狀測定和稻米品質(zhì)分析。結(jié)果顯示bzr1的基本農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)均無明顯改變。bzr4-1和bzr4-2株高變矮，劍葉長寬比和穗粒數(shù)減少，堊白度明顯增加;稻米品質(zhì)中RVA譜的峰值粘度、熱漿粘度、冷膠粘度均下降，且淀粉一級(jí)結(jié)構(gòu)長B鏈含量顯著降低。d61-1和d61-2株高降低，分蘗數(shù)減少，劍葉長寬比增加，籽粒變短變寬，堊白度顯著減少;表觀直鏈淀粉

4、含量AAC明顯增加，RVA譜的峰值粘度、熱漿粘度和冷膠粘度均升高，低分子量淀粉顯著減少。
　　2、利用CRISPR/Cas9基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，創(chuàng)建了水稻BZR家族4個(gè)基因的基因敲除水稻。為獲得單基因及多基因同時(shí)敲除的遺傳材料，我們在4個(gè)基因外顯子上分別選擇各基因特異性和保守性序列作為基因編輯的靶位點(diǎn)。DNA測序鑒定結(jié)果表明，BZR家族各成員的單基因和多基因突變體水稻已構(gòu)建成功，且突變種類豐富。具體而言，BZR1～BZR4的單基因

5、突變體分別包括6種（D1、 D3、D4、D5、D9和I1）、5種(D3、I1、S1、S2和S3)、5種（D1、D2、D5、D8和I1）和2種(D4和D5)突變類型;雙突變體包括BZR1BZR2、BZR1 BZR3和BZR2 BZR3三種基因組合，每種組合又分別包括4種、17種和2種突變組合類型;三基因突變體BZR1 BZR2 BZR3包括8種突變類型(D1-S4-D2、D1-I1-D4、 D3-D3-D4、D1-D3-D4、D3-D3-

6、I1、I1-D3-I1、I1-S1-I1和I1-S1-D3）。這些突變體的創(chuàng)建為后續(xù)系統(tǒng)開展水稻BZR基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)。
　　3、將BR合成關(guān)鍵基因OsDWF4分別克隆到由胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1和組成型表達(dá)啟動(dòng)子Ubi驅(qū)動(dòng)的過表達(dá)載體pCAMBIA-Gt1和pCAMBIA-Ubi并轉(zhuǎn)入受體品種鹽稻8號(hào)。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行分子鑒定、表達(dá)分析、農(nóng)藝性狀鑒定和稻米品質(zhì)分析。分子鑒定結(jié)果顯示已成功獲得46個(gè)pGt1∷ OsDW