茯苓發(fā)酵生產(chǎn)條件優(yōu)化及其多糖的提取分離與生物活性研究.pdf

1、目的：對(duì)茯苓的液體發(fā)酵進(jìn)行研究，確定茯苓液體發(fā)酵的最適發(fā)酵培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件；從發(fā)酵液中分離提取茯苓多糖，并對(duì)其中的胞外多糖進(jìn)行純化、結(jié)構(gòu)分析和體外抗氧化活性研究。 方法：(1)采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，對(duì)6株不同來(lái)源的茯苓菌株進(jìn)行活化、復(fù)壯； (2)測(cè)定發(fā)酵液pH值、還原糖含量和菌體量，繪制茯苓液體發(fā)酵生長(zhǎng)曲線；觀察記錄不同固體斜面培養(yǎng)基菌齡對(duì)發(fā)酵適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間的影響； (3)在單因素分析(溫度、

2、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量、碳源種類和氮源種類)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L934正交分析，優(yōu)化茯苓液體發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件； (4)采用水提醇沉的方法和苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，從發(fā)酵液中分別提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖，并將胞外多糖依次通過(guò)sevag法去除蛋白、透析和DEAE-52柱純化分級(jí)得單一組分，用HPLC法檢測(cè)純度； (5)通過(guò)液相色譜、氣相色譜、紅外光譜、紫外光譜等方法和化學(xué)分析法初步鑒定純化組分的組成及部分理化性能；

3、 (6)通過(guò)芬頓(Fenton)反應(yīng)、鄰苯三酚自氧化法、H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血抗脂質(zhì)過(guò)氧化等方法，測(cè)定茯苓多糖的體外抗氧化性。 結(jié)果：(1)6株菌種皆生長(zhǎng)良好，活化、復(fù)壯成功；其中ACCC50864成活率高、生長(zhǎng)迅速，選定為下階段試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)菌株。 (2)繪制出茯苓液體發(fā)酵生長(zhǎng)曲線，并確定25日齡為最適固體斜面培養(yǎng)基菌齡。 (3)正交試驗(yàn)結(jié)果表明，茯苓發(fā)酵的最適培養(yǎng)條件為：溫度26℃、轉(zhuǎn)速140r/min、接種

4、量10％、裝液量100mL/250mL；碳源葡萄糖，濃度2.5％，氮源牛肉浸膏，濃度2％，KH2PO4/MgSO4為0.6％/0.3％，維生素 B14mg/100mL。 (4)茯苓胞外多糖經(jīng)DEAE-52分離，得到一種均一組分LLPS I，經(jīng)HPLC鑒定為單一組分。 (5)LLPS I經(jīng)IR圖譜分析分析顯示具有多糖的特征吸收峰，主鏈以β-型糖苷鍵連接為主；經(jīng)紅外和紫外綜合分析表明LLPS I中沒(méi)有N、S元素存在，應(yīng)為非氨

5、基糖；經(jīng)TLC和GC分析其單糖組成為葡萄糖(Glc)。 (6)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，茯苓胞外多糖具有較好的抗氧化作用。在多糖濃度為3.5mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基清除率達(dá)56.2％；對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除作用；當(dāng)多糖濃度為5mg/mL時(shí)，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率可達(dá)43％；當(dāng)濃度為5mg/mL時(shí)對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化作用抑制率達(dá)到68.2％。 結(jié)論：確定了茯苓發(fā)酵的最適發(fā)酵培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件；對(duì)純化組分