心葉煙RNA依賴的RNA聚合酶基因(NgRDR1)的克隆及其表達特性研究.pdf

1、植物中RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RDR)早在上世紀(jì)七十年代首次在中國卷心菜中發(fā)現(xiàn)，隨后又陸續(xù)在花椰菜、煙草、番茄、豇豆、黃瓜、水稻、大麥、玉米等植物中發(fā)現(xiàn)。RDR在RNA沉默，異染色質(zhì)形成和基因的調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用。本文以心葉煙(Nicotiana glutinosa)為實驗材料，首次從心葉煙中克隆得到RDR基因(NgRDR1)，并對其進行了序列比對，表達特性分析及初步功能

2、鑒定，為進一步研究該基因的功能及作用機理奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1、利用同源序列設(shè)計兼并引物，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法從心葉煙中克隆得到一個RDR基因，命名為NgRDR1。GenBank注冊號為EF646264，其全長3635 bp，編碼一個1117氨基酸的蛋白質(zhì)。序列分析發(fā)現(xiàn)，NgRDR1具有RDRa的功能保守區(qū)，該保守區(qū)內(nèi)存在典型保守基序DbDGD(b代表任一殘基)，它是二價陽離子結(jié)合并產(chǎn)生催化活性的

3、位點。NgRDR1同來源于大麥、擬南芥、番茄、煙草中的幾種RDRs具有較高同源性，同源性高達55-94％。cDNA序列與基因組序列比對后發(fā)現(xiàn)NgRDR1基因組序列內(nèi)存在四個內(nèi)含子，其中一個內(nèi)含子位于5'UTR內(nèi)。 2、通過LAPCR和反向PCR方法獲得了1333 bp的目的基因啟動子序列，經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)：該區(qū)域中存在HSE(heat shock element)、MeJA(methyl jasmonate)、生長素等響應(yīng)元件，A

4、E、ATCT-motif、G-box、I-Box等一些光誘導(dǎo)有關(guān)的元件。半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，NgRDR1轉(zhuǎn)錄水平受SA(salicylic acid)、INA(isonicotinic acid)、H2O2(hydrogen peroxide)、和MeJA的誘導(dǎo)而提高；心葉煙接種病毒PVY(Potato virus Y)、TMV(Tobacco mosaic virus)和CMV(Cucumber mosaic virus)后，Ng

5、RDR1表達量也有明顯提高，并且在接種不同種類的真菌后，也能誘導(dǎo)NgRDR1的表達，可以推測NgRDR1參與了病原侵染反應(yīng)過程。 3、將NgRDR1構(gòu)建了正義植物表達載體pROKII-NgRDR1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化本生煙(Nicotiana benthamiana)，同時轉(zhuǎn)空載體作為對照。經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)過PCR鑒定及半定量RT-PCR分析，結(jié)果證明NgRDR1在轉(zhuǎn)基因煙草中得到成功表達。 4