草魚g-型和c-型溶菌酶基因的克隆、組織分布與原核表達(dá).pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國淡水養(yǎng)殖最重要的魚類品種之一，位居“四大家魚”之首。草魚養(yǎng)殖業(yè)在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要的意義。在草魚養(yǎng)殖過程極易發(fā)生病害。對于養(yǎng)殖魚類而言，免疫防治是控制疾病重要而有效的途徑。由于魚類特異性免疫系統(tǒng)尚不完善，因此非特異性免疫因子在抵抗外來病原的入侵中起重要作用。溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異免疫因子之一，在引發(fā)和維持機(jī)體防御免疫的過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)克隆了草魚g-型和c-型

2、溶菌酶基因全長cDNA，并用熒光定量PCR方法檢測了草魚正常個(gè)體和受嗜水氣單胞菌感染后各組織中溶菌酶基因的表達(dá)情況，初步評價(jià)它們的免疫防御功能。同時(shí)應(yīng)用基因工程技術(shù)將兩種溶菌酶基因成熟肽cDNA導(dǎo)入原核表達(dá)載體獲得重組草魚溶菌酶，并比較二者的活性與抗菌譜，探討兩種草魚溶菌酶的免疫防御功能，為進(jìn)一步開展魚類免疫分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。 1.草魚g-型和c-型溶菌酶基因的克隆與序列分析 采用RT-PCR和5’RACE技術(shù)分別

3、從草魚的肝臟組織的法分別擴(kuò)增出g-型和c-型溶菌酶的3’和5’端序列。mRNA中獲得特異性cDNA3’和5’片段，將3’和5’端序列用vector軟件拼接獲得純化后克隆到pMD18-T載體中，重組子經(jīng)測序、和序列拼接，獲得草魚g-型和c-型溶菌酶cDNA。序列分析表明草魚g-型溶菌酶基因cDNA全長為777bp，包括558 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼185個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)分別為107 bp和112 bp。草魚g

4、-型溶菌酶中存在g-型溶菌酶所具有的3個(gè)保守的催化殘基(Glu73，Asp86，Asp97)；和其他魚類一樣，草魚g-型溶菌酶不具有哺乳動(dòng)物和鳥類所具有的保守的二硫鍵，表明草魚g-型溶菌酶是非分泌性蛋白。氨基酸序列同源性分析表明，草魚g-型溶菌酶與已知的牙鲆、大黃魚和鯉魚等魚類的同源性在55％-79％之間。與斑馬魚的同源性最高，為79％，與大西洋鱈的同源性最低的，為55％。草魚c-型溶菌酶基因全長cDNA，含438 bp的ORF，編碼1

5、45個(gè)氨基酸，前18個(gè)氨基酸殘基為信號肽。5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)分別為75bp和175bp，草魚c-型溶菌酶中存在著典型的c-型溶菌酶所具有的兩個(gè)保守的催化位點(diǎn)Glu53(E)和Asp70(D)與8個(gè)保守的半胱氨酸Cys(C)。草魚c-型溶菌酶在101、106、107位置不具有鈣結(jié)合亞型3個(gè)保守的Asp(D)，屬于c-型溶菌酶中的非鈣結(jié)合亞型。氨基酸序列同源性分析表明，草魚c-型溶菌酶與已知的圓鲆、塞內(nèi)加爾鰨和鯉魚等魚類的同源性在3

6、4％-82％之間。與鯉魚同源性最高，為82％，與奧利亞羅非魚同源性最低，為34％。 2.草魚g-型和c-型溶菌酶的組織表達(dá) 2.1兩種溶菌酶在草魚正常個(gè)體中的組織分布 用熒光定量PCR方法對兩基因的mRNA水平的組織分布進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示在正常草魚中所檢測的11種組織均有g(shù)-和c-型溶菌酶基因表達(dá)，但二個(gè)基因的組織表達(dá)量不同，g-型溶菌酶在所檢測的各組織中表達(dá)量較均一，但與c-型溶菌酶基因相比，大多數(shù)組織的表達(dá)

7、水平均較低。c-型溶菌酶各組織中表達(dá)量差異較大，在頭腎中高表達(dá)(是腦的444.8倍)。 2.2人工感染嗜水氣單胞菌后兩種溶菌酶基因在草魚各組織中的表達(dá) 人工感染實(shí)驗(yàn)顯示，感染嗜水氣單胞菌后g-和c-型溶菌酶基因表達(dá)均有上調(diào)，g-型溶菌酶基因的表達(dá)總體上調(diào)幅度比c-型溶菌酶的大。在所檢測的4種組織中，g-型和c-型兩種溶菌酶在肝臟的表達(dá)水平升幅最大(分別是對照組的12.6倍和5.2倍)，脾臟和鰓中g(shù)-型溶菌酶基因的表達(dá)水平

8、也顯著性升高。頭腎中二種基因表達(dá)上調(diào)的幅度均較小，g-型溶菌酶在頭腎中出現(xiàn)高峰時(shí)間的較遲，第7d才達(dá)到最高峰，但到14d時(shí)仍維持高水平。人工感染結(jié)果表明草魚g-型溶菌酶和c-型溶菌酶均具有抵抗細(xì)菌入侵的作用，但二者可能存在著不同的作用機(jī)制及功能上的分工。 3.草魚g-型和c-型溶菌酶基因的原核表達(dá)、蛋白純化及活性檢測 將二種溶菌酶基因的成熟肽cDNA分別插入表達(dá)載體pET-30c(+)，構(gòu)建重組His融合表達(dá)載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化

9、大腸桿菌、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測到分子量約30 kD和20kD的特異蛋白帶，分別與預(yù)期的g-型溶菌酶和c-型溶菌酶分子大小相符，表明實(shí)驗(yàn)成功獲得了兩種溶菌酶的融合表達(dá)蛋白。 重組蛋白經(jīng)His Bind柱純化后，依照比濁法檢測其溶菌酶活性。結(jié)果顯示重組草魚溶菌酶活力檢測顯示兩種重組溶菌酶對溶壁微球菌和6種水生動(dòng)物病原菌均具有溶菌活性，但二種重組酶對不同菌的溶菌活性不同?；盍z測結(jié)果佐證了二種溶菌酶在草魚體內(nèi)的免疫防

10、御功能及功能上存在的分工。 小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)克隆了二種草魚溶菌酶——g-型和c-型溶菌酶，它們均具有相應(yīng)的酶典型結(jié)構(gòu)特征。兩種溶菌酶在正常個(gè)體中均具有廣泛的組織分布，但組織分布模式不同，g-型溶菌酶各組織表達(dá)量均較c-型溶菌酶的低，c-型溶菌酶在頭腎中高水平表達(dá)，推測c-型溶菌酶是草魚機(jī)體正常情況下的主要免疫防御因子。人工感染細(xì)菌后，二個(gè)基因的表達(dá)均上調(diào)，g-型溶菌酶基因上調(diào)幅度均較c-型溶菌酶基因的高。二個(gè)基因在肝臟的上調(diào)幅度均最