黃鱔和歐洲鰻鱺胃蛋白酶原的分離純化與酶的性質(zhì)研究.pdf

1、胃蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族中專門水解蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶,在魚體內(nèi)起著重要的生理和消化功能。在低溫下仍然具有高活性的魚體胃蛋白酶對(duì)食品加工、魚類餌料配置具有重要意義。但是,迄今為止國內(nèi)外對(duì)淡水魚胃蛋白酶的報(bào)道較少。本研究以淡水黃鱔和歐洲鰻鱺為材料,通過硫酸銨鹽析、DEAE-Sephacel離子交換層析以及Sephacryl S-200、Superde×75凝膠過濾層析等方法分別從黃鱔胃內(nèi)純化得到四種胃蛋白酶原,從歐洲鰻

2、鱺胃內(nèi)純化得到三種胃蛋白酶原,并對(duì)相應(yīng)酶的性質(zhì)進(jìn)行了比較分析。本研究為胃蛋白酶的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為這兩種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值魚類的消化生理研究打下基礎(chǔ)。主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前體,在酸性條件下酶原從N端失去30-50個(gè)氨基酸殘基片段后轉(zhuǎn)變成活性酶的形式;SDS-PAGE顯示純化得到的四種黃鱔的胃蛋白酶原(PG-Ⅰ,PG-Ⅱ,PG-Ⅲ(A)及PG-Ⅲ(B))的分子量為36,36,36和35 kDa;相應(yīng)的

3、四種胃蛋白酶(P-Ⅰ,P-Ⅱ,P-Ⅲ(A)及P-Ⅲ(B))的分子量分別為32,32,31和32 kDa;歐洲鰻鱺的三種胃蛋白酶原(PG-Ⅰ,PG-Ⅱ和PG-Ⅲ)和相應(yīng)的胃蛋白酶(P-Ⅰ,P-Ⅱ和P-Ⅲ)的分子量分別約為36,30;37,30;37和30 kDa。
　　 ⑵以酸變性牛血紅蛋白為底物,四種黃鱔胃蛋白酶的最適pH分別為3.5,3.0,3.0和3.0,最適溫度分別為40,40,35和35℃;歐洲鰻鱺三種胃蛋白酶的最適pH

4、分別為3.5,2.5和2.5,最適溫度分別為40,40和35℃。來自這兩種魚的胃蛋白酶都屬于酸性蛋白酶(天冬氨酸蛋白酶),pepstatin是它們的有效抑制劑,但抑制效果略有不同。四種黃鱔胃蛋白酶對(duì)酸變性牛血紅蛋白的Km值和Kcat分別為:1.2×10-4mol/L,23.2 s-1;8.7×10-5mol/L,24.0 s-1;6.9×10-5mol/L,42.6s-1;8.8×10-5mol/L和25.9 s-1;Kcat/Km值依

5、次是1.9×105mol-1·L·s-1,2.8×105mol-1·L.s-1,6.1×105mol-1·L·s-1以及3.0×105mol-1·L·s-1。三種歐洲鰻鱺胃蛋白酶對(duì)酸變性血紅蛋白的Km值和Kcat分別為:8.8×10-5mol/L,23.7 s-1;9.2×10-5mol/L,19.4 s-1;7.0×10-5mol/L,和34.4 s-1;Kcat/Km依此是2.7×105mol-1·L·s-1,2.1×105mol-

6、1·L·s-1和4.9×105mol-1·L·s-1。
　　 ⑶用大鼠抗黃鰭鯛PG-Ⅰ,PG-Ⅱ,PG-Ⅲ和PG-Ⅳ多克隆抗體作為一抗,分別與四種黃鱔胃蛋白酶原做Western blot,結(jié)果顯示黃鱔PG-Ⅲ(A)和PG-Ⅲ(B)均能與四種多抗發(fā)生強(qiáng)烈的免疫交叉反應(yīng),而黃鱔PG-Ⅰ和PG-Ⅱ不能與大鼠抗黃鰭鯛PG-Ⅲ發(fā)生免疫交叉反應(yīng),與另外三種多抗可以發(fā)生免疫交叉反應(yīng);歐洲鰻鱺PG-Ⅱ,PG-Ⅲ均能與四種多抗發(fā)生免疫交叉反應(yīng),P