小麥矮腥黑穗菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)體系的建立及基因組文庫的構(gòu)建.pdf

1、小麥矮腥黑穗病(Wheat Dwarf Bunt Disease，DB)是一種重要的國際檢疫性病害，在麥類黑穗病中危害最大，對(duì)小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害，其病原菌是小麥矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn，TCK)，主要分布在美洲、歐洲、北非和西亞，尤其是美國西北部7州。TCK作為一種典型的土傳病害，目前還沒有有效的防治方法。從六十年代起，我國就把此病害列為檢疫對(duì)象，并多次從美國、加拿大、歐盟的進(jìn)口小麥中截獲具有侵

2、染活性的TCK。小麥矮腥黑穗病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估表明，我國有19.3％的冬小麥種植區(qū)屬中、高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，目前我國種植的小麥品種都是易感品種，引進(jìn)的抗病品種選育正在進(jìn)行。
　　 植物有害生物的檢測(cè)方法很多，包括癥狀目測(cè)法、病原菌分離培養(yǎng)及致病性測(cè)定法、血清學(xué)鑒定以及PCR檢測(cè)技術(shù)等，特別是PCR技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用使植物疫害生物的檢驗(yàn)檢疫工作有了一種更加快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的檢測(cè)方法。然而除了PCR技術(shù)之外，其它技術(shù)都存在工作量

3、大、耗時(shí)費(fèi)事、主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)，不能滿足進(jìn)境原糧檢疫的快速通關(guān)以及進(jìn)境后疫麥中病原菌消長動(dòng)態(tài)與流向監(jiān)控的需求。并且所有的這些檢測(cè)技術(shù)都只能檢測(cè)單一的靶標(biāo)。而進(jìn)口麥類種子往往攜帶多種黑粉菌；盡管多重PCR能夠進(jìn)行多靶標(biāo)檢測(cè)，但是，不同引物對(duì)之間的競(jìng)爭和相互抑制常常影響到檢測(cè)的特異性和穩(wěn)定性，使得檢測(cè)體系難以優(yōu)化而且不夠穩(wěn)定。鎖式探針(padlock probe)是一種較長的單鏈寡核苷酸片段，兩個(gè)末端在靶標(biāo)序列上毗鄰并互補(bǔ)，中間的一段連接序列

4、對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響，可以用來設(shè)計(jì)擴(kuò)增鎖式探針的通用引物。鎖式探針這種獨(dú)特的設(shè)計(jì)，滿足了特異性與多靶標(biāo)檢測(cè)的需要，具有多種擴(kuò)增方式，還能夠攜帶檢測(cè)標(biāo)記物，是一種可以適應(yīng)多種植物病原菌同步檢測(cè)的技術(shù)。
　　 本研究以重要植物檢疫性病害小麥矮腥黑穗菌為研究對(duì)象，以TCK獨(dú)有序列(1322bp)作為檢測(cè)靶標(biāo)片段，以小鼠保守的Xist基因序列作為鎖式探針的通用連接序列，設(shè)計(jì)鎖式探針及其擴(kuò)增引物；通過優(yōu)化連接體系、外切酶消化體系和滾環(huán)擴(kuò)增程

5、序，以構(gòu)建小麥矮腥黑穗病菌的超分支滾環(huán)擴(kuò)增(hyper-branched rollingcircle amplification，HRCA)體系，并以常規(guī)PCR和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR作驗(yàn)證，測(cè)試滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)的特異性、靈敏度；通過實(shí)際樣品的檢測(cè)確定了小麥矮腥黑穗菌滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的特異性和靈敏度和穩(wěn)定性，為出入境植物檢驗(yàn)檢疫提供了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的新檢測(cè)技術(shù)。構(gòu)建小麥矮腥黑穗菌基因組DNA文庫，為后續(xù)功能基因的篩選、鑒

6、定以及致病機(jī)制和小麥的抗矮腥黑穗病遺傳育種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①根據(jù)小麥矮腥黑穗病菌(TCK)獨(dú)有序列設(shè)計(jì)一條特異的鎖式探針，并對(duì)探針的特異性及其?；赃M(jìn)行了測(cè)試，實(shí)驗(yàn)表明設(shè)計(jì)的鎖式探針能識(shí)別單堿基錯(cuò)配，當(dāng)錯(cuò)配位置在PLP的3’端時(shí)，很容易被識(shí)別而不會(huì)被連接，但是當(dāng)錯(cuò)配位置在PLP的5’端時(shí)，將不容易被識(shí)別。表明設(shè)計(jì)的鎖式探針具有良好的位點(diǎn)專一性，能夠用于靶標(biāo)疫害生物的檢測(cè)。
　　 ②建立了基于鎖式探針的

7、小麥矮腥黑穗菌滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)體系，為小麥矮腥黑穗病的早期診斷提供了一種新的穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)技術(shù)。能專一的檢測(cè)出不同TCK菌株的DNA靶帶，而對(duì)TCT的不同菌株和其他近源種DNA以及健康小麥樣品都不能擴(kuò)增，特異性檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR的相同；HRCA檢測(cè)體系對(duì)重組質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1fg/μL，相當(dāng)于靶標(biāo)基因拷貝數(shù)220 copy/μL，對(duì)TCK基因組DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 pg/μL，比常規(guī)PCR的靈敏度高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，而比SYBRG

8、reenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，表明建立的HRCA檢測(cè)體系具有良好的特性、靈敏度。
　　 ③建立的HRCA檢測(cè)體系初步應(yīng)用于田間樣品中TCK的早期鑒定，可快速鑒定小麥矮腥黑穗菌冬孢子和菌絲體，小麥植株樣品的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果與PCR驗(yàn)證結(jié)果基本一致，表明所建立的滾環(huán)擴(kuò)增體系適合于小麥矮腥黑穗菌實(shí)際樣品的早期診斷鑒定。
　　 ④建立了小麥矮腥黑穗菌大片段基因組DNA文庫，文庫的滴度為1.8×10cfu/ml，