文蛤外套膜和肝胰臟組織cDNA文庫的構(gòu)建及其線粒體全基因組序列的擴增.pdf

1、文蛤(Meretrix meretrix)屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Lamellibranchia)、異齒亞綱(Heterodonta)、簾蛤目(Veneroida)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤?qū)?Meretrix)。文蛤是一種天然資源豐富的灘涂貝類，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，是重要的海水增養(yǎng)殖優(yōu)良品種，也是主要出口的鮮活水產(chǎn)品之一。本研究構(gòu)建了文蛤外套膜和脾臟組織的cDNA文庫、EST測序、序列分析，設(shè)計引物擴

2、增線粒體基因組序列，并利用生物信息學(xué)方法，對16種雙殼貝類的線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特征進行了研究。
　　 1.運用TRIZOL Reagent提取文蛤外套膜和脾臟組織的總RNA，用SMART cDNALibrary Construction Kit構(gòu)建cDNA文庫。經(jīng)測定原始文庫滴度分別為1.70×106和1.60×106，重組率分別為96.5％和95.2％，插入片段平均長度分別為705 bp和750 bp，文庫質(zhì)量符合標準要求。<

3、br>　　 2.隨機選取文庫的2112個克隆進行5’端測序，獲得高質(zhì)量EST序列2023個(外套膜：1019，肝胰臟：1004)，測序成功率95.8％。經(jīng)質(zhì)量控制和拼接得到1322個單基因簇(Unigene)，其中231個疊聯(lián)群(Contigs)，1147個單一序列(Singletons)。通過Blastx和Blastn搜索比對、查詢和注釋分析，共得到已知基因480個(外套膜：235個；肝胰臟：245個)，占總數(shù)36.3％。
　

4、　 3.利用Gene Ontology法對所有ESTs進行基因功能分析，建立了文蛤不同組織的基因表達譜，表明參與結(jié)合和催化分子功能的基因的表達非?；钴S。
　　 4.在1322個Unigene發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列32條，設(shè)計引物22對，這些存在微衛(wèi)星位點的序列占整個ESTs數(shù)據(jù)庫的2.3％。
　　 5.根據(jù)文蛤cDNA文庫中篩選出的線粒體基因片段設(shè)計正反向引物(CO3-F與ND5-R，ND5-F與C03-R)，擴增了10 kb