TGEV-PRCV鑒別診斷方法的建立及TGEVN蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastroenteritis, TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV）引起的一種高接觸性傳染病，主要引起一周齡以下仔豬發(fā)生嘔吐、水樣腹瀉和死亡（死亡率通常為100％）。豬傳染性胃腸炎流行遍布全世界，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory c

2、oronavirus, PRCV）是TGEV的基因缺失變異株，其與TGEV核苷酸序列同源性達96％。TGEV和PRCV基因結(jié)構(gòu)十分相似，抗原相關(guān)，產(chǎn)生的中和抗體有交叉反應(yīng)，傳統(tǒng)血清學(xué)方法很難將二者區(qū)分開。PRCV與TGEV相比，其S基因5’末端有大量堿基缺失，不同PRCV毒株的堿基缺失情況各不相同，缺失從621～681個堿基不等，并導(dǎo)致PRCV失去兩個抗原位點。目前，各國PRCV感染現(xiàn)象呈現(xiàn)日益嚴(yán)重的趨勢，并且常在TGEV感染豬群中發(fā)生

3、，造成TGEV血清轉(zhuǎn)陽現(xiàn)象，因此建立一種TGEV與PRCV的鑒別診斷方法尤其重要。
　　 本研究根據(jù)已發(fā)表的PRCV基因組序列中的S基因序列和本實驗室測定的TGEV華毒弱毒株的S基因序列進行比對分析，在S基因缺失區(qū)兩端分別設(shè)計了兩套引物P1、P2、P3、P4，以TGEV和PRCV細胞培養(yǎng)物為材料提取RNA，進行套式RT-PCR特異性片段擴增，TGEV P1、P2擴增片段大小為1338bp，P3、P4擴增片段大小為936bp，PR

4、CV擴增片段分別為717bp、315bp。經(jīng)過正交設(shè)計優(yōu)化后建立的套式RT-PCR方法經(jīng)過特異性、敏感性試驗檢測，只有TGEV與PRCV有特異性條帶被擴增出，其他病毒（PEDV、PRRSV、SIV、PRoV、PRV、HCV）均未擴增出特異條帶，TGEV與PRCV病毒最低檢測量均為4 TCID50/mL，證明本法具有快速、特異和高度敏感的特點。
　　 本研究還設(shè)計建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法用來鑒別區(qū)分TGEV與PRCV。根據(jù)已發(fā)表的

5、PRCV基因組序列中的S基因序列和本實驗室測定的TGEV華毒弱毒株的S基因序列進行對比分析，在S基因缺失區(qū)和共同區(qū)分別設(shè)計一套引物Q-FIP、Q-BIP、Q-F3、Q-B3與QX-FIP、QX-BIP、QX-F3、QX-B3，以TGEV與PRCV細胞培養(yǎng)物為材料提取RNA，進行特異性LAMP片段擴增，其中TGEV在Q系列引物擴增下會出現(xiàn)典型的LAMP梯度條帶，Q系列引物擴增最小帶為184bp，而PRCV在QX系列引物擴增時出現(xiàn)條帶，片段

6、大小194bp。經(jīng)過正交設(shè)計優(yōu)化后建立的LAMP方法經(jīng)過特異性、敏感性實驗檢測，只對TGEV與PRCV擴增出現(xiàn)條帶，而其他病毒（PEDV、PRRSV、PRoV）無條帶出現(xiàn)，均為陰性。此方法可檢測到的TGEV與PRCV病毒最低量為0.1TCID50/mL。證明本法具有快速、特異和高度敏感的特點。本方法采用美萊博公司的熒光染料SmartGreenⅠ與MgCl2進行肉眼及熒光可視檢測，可以很容易的區(qū)分出陰陽性反應(yīng)，方便現(xiàn)地檢測病料。
　

7、　 上述兩種方法的建立可以很好地鑒別診斷和區(qū)分TGEV與PRCV病毒，并且兩種方法的特異性和敏感性都很高，相比較起來RT-LAMP方法比套式RT-PCR方法更敏感，且更適于現(xiàn)地病料檢測。
　　 本研究采用原核表達的TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)方法進行細胞融合，間接ELISA方法進行篩選，抗原為TGEV N蛋白。采用有限稀釋法，經(jīng)過四次克隆，最終獲得三株抗TGEV N蛋白的雜交瘤細胞株（1A9、1G7、1H8）。

8、三株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體亞型均為IgG1型，雜交瘤細胞經(jīng)過體外長期培養(yǎng)和凍存均未影響抗體的分泌。間接ELISA檢測1A9、1G7、1H8細胞培養(yǎng)上清的抗體效價分別為1:640、1:320、1:800，腹水抗體效價分別為1:6400、1:6400、1:12800 。用獲得的單克隆抗體和SP2/0細胞培養(yǎng)上清為一抗，感染TGEV的ST細胞培養(yǎng)物為抗原進行間接免疫熒光實驗，熒光二抗孵育作用后，與單克隆抗體作用的細胞培養(yǎng)物中，多數(shù)細胞在其

9、胞漿和細胞膜上出現(xiàn)強熒光，與SP2/0細胞培養(yǎng)上清作用未見出現(xiàn)熒光，結(jié)果表明，利用所制備的單克隆抗體進行間接免疫熒光對病原檢測具有較高的特異性。用單克隆抗體與TGEV和TGEV N蛋白進行westernblot實驗：熒光素二抗作用后用紅外熒光掃描成效系統(tǒng)進行掃描，發(fā)現(xiàn)只在TGEV N蛋白處出現(xiàn)特異性條帶，而TGEV病毒其他蛋白處未有特異性條帶出現(xiàn)。結(jié)果說明，利用所制備的單克隆抗體進行westernblot對病原檢測具有較高的特異性。