海洋疏浚物生物毒性檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、海洋傾廢是一種利用海洋的自?xún)裟芰铜h(huán)境容量來(lái)處理廢棄物質(zhì)的方式,是海洋空間資源環(huán)境效益的重要體現(xiàn)。隨著經(jīng)濟(jì)建設(shè)的快速發(fā)展,疏浚物海洋傾廢活動(dòng)日益頻繁,如何快速有效的對(duì)海洋傾廢疏浚物進(jìn)行毒性監(jiān)測(cè),避免毒性疏浚物傾倒活動(dòng)對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害成為生態(tài)環(huán)境保護(hù)的重要課題。本實(shí)驗(yàn)以海洋疏浚物為材料,進(jìn)行生物毒性快速檢測(cè)技術(shù)研究。通過(guò)研究發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)法和數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序方法,建立以發(fā)光細(xì)菌毒性半數(shù)效應(yīng)濃度為依據(jù)的疏浚物毒性分級(jí)技術(shù)并從分子

2、水平迅速確定污染疏浚物的潛在生物毒性效應(yīng),構(gòu)建快速、高效的疏浚物生物毒性檢測(cè)技術(shù),完善當(dāng)前傾廢物生物檢驗(yàn)方法,為海洋傾廢管理提供技術(shù)支撐。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1基于發(fā)光細(xì)菌的海洋疏浚物生物毒性檢測(cè)技術(shù)的研究
　　本實(shí)驗(yàn)參照我國(guó)《水質(zhì)急性毒性測(cè)定-發(fā)光細(xì)菌法》(GB/T15441-1995)標(biāo)準(zhǔn)辦法,研究了 pH、測(cè)量時(shí)間、助溶劑(DMSO)等測(cè)試條件以及檢測(cè)樣品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氨氮、總氮、總磷、總碳含量等對(duì)明亮發(fā)光桿菌和費(fèi)氏弧

3、菌發(fā)光強(qiáng)度的影響,從而建立了發(fā)光細(xì)菌微孔板毒性檢測(cè)方法。
　　(1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以確定當(dāng)檢測(cè)體系pH分別在4-9和5-8范圍之間時(shí),酸堿度變化對(duì)明亮發(fā)光桿菌和費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度不產(chǎn)生顯著影響(P<0.05),因此當(dāng)待測(cè)疏浚物溶出液pH在7±1范圍內(nèi)時(shí)可直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需調(diào)節(jié)pH;以特征污染物為檢測(cè)對(duì)象,反應(yīng)進(jìn)行到15 min時(shí)EC50逐漸開(kāi)始趨于穩(wěn)定,因此實(shí)驗(yàn)選取15 min-EC50作為反應(yīng)判定終點(diǎn);作為有機(jī)污染物助溶劑,D

4、MSO對(duì)明亮發(fā)光桿菌和費(fèi)氏弧菌毒性作用顯著,但在低于1.5％的DMSO對(duì)兩種發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度不具有抑制作用;氨氮、磷、碳和氮會(huì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生微弱的刺激作用,而加標(biāo)實(shí)驗(yàn)表明疏浚物溶出液體系中磷、碳和氮對(duì)發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度影響不顯著。
　　(2)利用發(fā)光細(xì)菌微孔板毒性檢測(cè)方法,測(cè)定了疏浚物中10種特征污染物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制毒性并對(duì)毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合和預(yù)測(cè),結(jié)果表明ZnSO4.7H2O、K2Cr2O7、HgCl2、CdCl

5、2.2.5H2O、Pb(NO3)2、Na2HAsO4和CuSO4.5H2O七種重金屬化合物的毒性作用關(guān)系均可以用Weibull模型或Logistic模型有效描述。幾種重金屬對(duì)明亮發(fā)光桿菌的毒性順序?yàn)镵2Cr2O7

6、7H2O　　(3)為比較發(fā)光細(xì)菌與其它海洋生物對(duì)重金屬毒性反應(yīng)的靈敏度水平,選擇海洋魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、蝦蟹類(lèi)和蚤類(lèi)的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相同條件下發(fā)光細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行物種敏感度分析,結(jié)果證明發(fā)光細(xì)菌對(duì)7種重金屬離子的 EC50值分布在由其它海洋生物毒性效應(yīng)值擬合的物種敏感度分布模型范圍內(nèi)。與

7、海洋魚(yú)類(lèi)、蚤類(lèi)、貝類(lèi)和蝦蟹類(lèi)相比,明亮發(fā)光桿菌對(duì) Cu2+的毒性靈敏度較差,但是對(duì)As5+、Cd2+、Pb2+、Hg2+、Zn2+和Cr6+的毒性靈敏度較高,多數(shù)海洋生物對(duì)六種重金屬的毒性響應(yīng)順序與發(fā)光細(xì)菌基本一致,說(shuō)明發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試法對(duì)于海洋環(huán)境重金屬污染的生態(tài)毒理效應(yīng)具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。基于已優(yōu)化的發(fā)光細(xì)菌法毒性快速測(cè)定方法對(duì)27個(gè)疏浚物樣品進(jìn)行毒性檢測(cè)和分級(jí),發(fā)現(xiàn)發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)方法與傳統(tǒng)理化毒性測(cè)試方法結(jié)果基本一致,證明了該檢測(cè)方法

8、的可行性。
　　2基于菲律賓蛤仔的海洋疏浚物生物毒性檢測(cè)技術(shù)的研究
　　本實(shí)驗(yàn)利用Hiseq2000/Illumina數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù),研究了兩個(gè)毒性疏浚物溶出液樣品48 h暴露對(duì)菲律賓蛤仔的生物學(xué)毒性,篩選了菲律賓蛤仔鰓組織的差異表達(dá)基因,并對(duì)14個(gè)重要通路關(guān)鍵調(diào)控基因進(jìn)行了RT-PCR分析。測(cè)序結(jié)果顯示,與對(duì)照組(自然海水)相比,菲律賓蛤仔在低毒性疏浚物樣品脅迫下861個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)而1305個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著抑制,在

9、中毒性疏浚物樣品脅迫下的369個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)而200個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著抑制,低毒與中毒處理組篩選出356個(gè)相同差異基因。GO功能顯著富集的基因主要涉及:氧化還原過(guò)程、炎癥應(yīng)答、糖代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能。通過(guò)KEGG Pathway顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,包括NF- KB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡途徑、Toll樣受體信號(hào)通路,其中NF-KB信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡通路較為顯著,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR