水稻線(xiàn)粒體ATP合成酶6kDa亞基基因的功能解析.pdf

1、該研究把碳酸鹽(NaHCO3、Na2CO3)對(duì)植物造成的逆境稱(chēng)為"碳酸鹽逆境"(Carbonate stress).從水稻根cDNA文庫(kù)中篩選出一些與碳酸鹽逆境相關(guān)的基因,水稻線(xiàn)粒體ATP合成酶6kDa亞基基因(簡(jiǎn)稱(chēng):RMtATP6基因)為其中之一.該基因編碼的氨基酸序列與Jansch等人(1996)從馬鈴薯(Solanum tuberosum)線(xiàn)粒體中純化的線(xiàn)粒體ATP合成酶6kDa亞基氨基酸序列(F1F0-ATP合成酶的F0部分)具

2、有同源性,但是這個(gè)小蛋白的功能尚不清楚,其基因也沒(méi)有被同定.在該研究中:這個(gè)基因被克隆(accession number:AB055076),在碳酸鹽逆境脅迫下它的表達(dá)特性被解析.RMtATP6基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)分子量為6.578 kDa,預(yù)測(cè)的細(xì)胞內(nèi)存在位置為線(xiàn)粒體膜間間隙,結(jié)果預(yù)示了RMtATP6基因編碼的蛋白為水稻線(xiàn)粒體ATP合成酶6kDa亞基基因.Southern雜交結(jié)果表明RMtATP6基因是水稻核基因組中的一個(gè)單拷貝基因.通

3、過(guò)對(duì)RMtATP6基因在植物中的表達(dá)特性及在碳酸鹽逆境下在酵母中的功能解析,表明了該基因與碳酸鹽逆境有關(guān).將RMtATP6基因與綠色熒光蛋白GFP基因融合,構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2中,通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將pYES2-RMtATP6-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVScl中,并將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用熒光染料Mito Tracker Red CmxRos(Molecular Probes)染色,利用激光共聚

4、焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Biological Microscope,OLYMPUS)觀(guān)察,從而對(duì)RMtATP6基因編碼的蛋白在酵母細(xì)胞中進(jìn)行定位.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:RMtATP6基因編碼的蛋白存在于酵母的線(xiàn)粒體中,這個(gè)結(jié)論與我們最初預(yù)測(cè)的RMtATP6基因編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在位置所得到的結(jié)果一致.為了更好的研究RMtATP6基因與碳酸鹽逆境的關(guān)系,將RMtATP6基因克隆到植物表達(dá)載體PBI121上,并

5、通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒PBI121-RMtATP6轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中,然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草.經(jīng)過(guò)生根篩選、PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè),證明RMtATP6基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中.將RMtATP6基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-3中,并將pGEX-6p-3-RMtATP6導(dǎo)入到Ecoli BL21菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),得到一個(gè)分子量約32 kDa的RMt