脊尾白蝦回交家系的遺傳特性及免疫功能研究.pdf

1、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）屬甲殼綱、十足目、長臂蝦科、白蝦屬，是一種中小型底棲蝦類，近年來成為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。回交作為重要的育種手段，因其可改變現(xiàn)有品種單個(gè)性狀、加速純系的培育而被廣泛應(yīng)用。為鑒定脊尾白蝦回交家系對(duì)于良種選育的應(yīng)用價(jià)值，本研究開發(fā)了脊尾白蝦31個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)及49個(gè)SNP位點(diǎn)，并利用這些標(biāo)記分析了脊尾白蝦3個(gè)回交家系的遺傳規(guī)律，揭示脊尾白蝦回交家系的優(yōu)良性狀及其相關(guān)

2、遺傳機(jī)制，為脊尾白蝦的標(biāo)記輔助育種提供參考；首次克隆了脊尾白蝦TRAF6基因cDNA全長，分析了其組織表達(dá)分布，并且研究了感染W(wǎng)SSV后TRAF6基因在脊尾白蝦野生群體和回交家系組織中的表達(dá)特征，探討了脊尾白蝦回交家系與野生群體TRAF6基因免疫表達(dá)的差異。
　　1.脊尾白蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及回交家系的遺傳結(jié)構(gòu)分析
　　本研究利用脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)，根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列自行設(shè)計(jì)了269對(duì)微衛(wèi)星引物，篩選出3

3、1個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，并用30尾野生個(gè)體進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)31個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目（Na）為2-9，平均等位基因數(shù)為4.19，其中微衛(wèi)星標(biāo)記ECL03、ECL27具有最多的等位基因數(shù)（9個(gè)）；平均觀測(cè)雜合度（Ho）為0.5787、平均期望雜合度（He）為0.6535，平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.5821，結(jié)果表明31個(gè)位點(diǎn)中有25個(gè)表現(xiàn)為高度多態(tài)，有6個(gè)表現(xiàn)為中度多態(tài)。
　　利用上述開發(fā)的25個(gè)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標(biāo)記分析了

4、本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的A、B、C三個(gè)回交家系的遺傳結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：回交家系A(chǔ)、B、C的平均等位基因數(shù)N分別為2.21、2.18、2.09，觀測(cè)雜合度Ho分別為0.3805、0.3703、0.2489，期望雜合度He分別為0.3629、0.3998、0.2503，多態(tài)信息含量PIC分別為0.3257、0.3391、0.2585，相較于野生群體已有了大幅度地降低，屬中度或低度多態(tài)；回交家系A(chǔ)、B、C在25個(gè)位點(diǎn)上共得到62個(gè)等位基因，其中A家系

5、56個(gè)，B家系54個(gè)，C家系51個(gè)，3個(gè)回交家系共同存在的等位基因39個(gè)，6個(gè)位點(diǎn)在回交家系中處于純合狀態(tài)（ECL10在A、B、C中都已純合），計(jì)算得出3個(gè)回交家系的純合率分別為53.86％、56.53%、63.33%，與野生群體16.91%相比顯著提高，可見回交群體的基因純化速率較快，適用于脊尾白蝦重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳解析和優(yōu)良種質(zhì)的選育。
　　2.脊尾白蝦生長性狀相關(guān)SNP的開發(fā)及其對(duì)回交家系的遺傳特性分析
　　為了發(fā)掘脊

6、尾白蝦與生長性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，篩選出生長相關(guān)候選基因片段11條，利用該基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到總長為4579 bp的DNA片段，通過直接測(cè)序法發(fā)現(xiàn)49個(gè)SNP位點(diǎn)，分布頻率為1.07/100bp，其中轉(zhuǎn)換突變的比例為78%，顛換突變的比例為22%，符合“transition bias”原理；通過直接測(cè)序法在脊尾白蝦野生群體及回交家系中成功分型了7個(gè)SNP位點(diǎn)，通過對(duì)SNP位點(diǎn)多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)所有SN

7、P位點(diǎn)并未偏離哈伯溫平衡（HWE），SNP標(biāo)記觀測(cè)雜合度（Ho）范圍為0.1667-0.5667，期望雜合度（He）范圍為0.3045-0.5079，上述SNP的MAF遠(yuǎn)大于0.05，說明這些SNP位點(diǎn)的多態(tài)性較高，適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；通過多元方差分析進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)與生長性狀顯著相關(guān)（P＜0.05），位點(diǎn)X2-261與體重、體長、腹節(jié)I寬和頭胸甲寬極顯著相關(guān)（P＜0.01）；9S-111與體重顯著相關(guān)（P＜0.05），該

8、結(jié)果有望應(yīng)用于脊尾白蝦的分子標(biāo)記輔助育種研究。
　　利用上述7個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)脊尾白蝦回交家系進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果表明回交家系SNP位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度（Ho）范圍為0.0333-0.2233，期望雜合度（He）范圍為0.1244-0.3300，與野生群體的雜合度相比都有所降低；7個(gè)位點(diǎn)的PIC值較低，這些證明回交家系等位基因的雜合基因型減少，純合基因型增多，使得多態(tài)性降低，這與上述微衛(wèi)星分析的結(jié)果相似。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)同一位點(diǎn)不同回交

9、家系間的雜合度并不一致，而相差較大，這可能與回交家系的父母本基因型有關(guān)。
　　3.脊尾白蝦TRAF6（TNF receptor associated factor6）基因的克隆及表達(dá)分析
　　首次克隆得到脊尾白蝦TRAF6基因，cDNA全長為2290bp，其開放閱讀框?yàn)?698bp，編碼566個(gè)氨基酸，其中包括TRAF6所特有的四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為RING型鋅指結(jié)構(gòu)、兩個(gè)TRAF型鋅指結(jié)構(gòu)、coiled-coil結(jié)構(gòu)域以及MA

10、TH結(jié)構(gòu)域。同源比對(duì)表明，脊尾白蝦TRAF6與斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）和中國對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）的同源性最高，達(dá)到73%，與凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的同源性次之，達(dá)到了72%。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了TRAF6基因在脊尾白蝦10種組織中的表達(dá)分布，發(fā)現(xiàn)其在10種組織中均有表達(dá)，在肝胰腺中表達(dá)最高，而在殼中的表達(dá)量最低，這可能由組織器官功能差異性所致。

11、
　　為了研究TRAF6基因在脊尾白蝦野生群體和回交家系免疫防御中的差異。本研究對(duì)脊尾白蝦野生群體及回交家系進(jìn)行WSSV感染后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)了肝胰腺和血細(xì)胞中TRAF6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果表明，病毒感染后TRAR6基因在肝胰腺和血細(xì)胞中的表達(dá)量在6h后均有明顯的上升趨勢(shì)，且在肝胰腺中感染后24 h達(dá)到最高值，血細(xì)胞中感染后12h達(dá)到最高值；對(duì)脊尾白蝦野生群體及回交家系TRAR6基因的表達(dá)特征進(jìn)行了