脊尾白蝦回交家系的遺傳特性及免疫功能研究.pdf

1、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）屬甲殼綱、十足目、長臂蝦科、白蝦屬，是一種中小型底棲蝦類，近年來成為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產養(yǎng)殖品種?；亟蛔鳛橹匾挠N手段，因其可改變現有品種單個性狀、加速純系的培育而被廣泛應用。為鑒定脊尾白蝦回交家系對于良種選育的應用價值，本研究開發(fā)了脊尾白蝦31個多態(tài)性微衛(wèi)星位點及49個SNP位點，并利用這些標記分析了脊尾白蝦3個回交家系的遺傳規(guī)律，揭示脊尾白蝦回交家系的優(yōu)良性狀及其相關

2、遺傳機制，為脊尾白蝦的標記輔助育種提供參考；首次克隆了脊尾白蝦TRAF6基因cDNA全長，分析了其組織表達分布，并且研究了感染WSSV后TRAF6基因在脊尾白蝦野生群體和回交家系組織中的表達特征，探討了脊尾白蝦回交家系與野生群體TRAF6基因免疫表達的差異。
　　1.脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的開發(fā)及回交家系的遺傳結構分析
　　本研究利用脊尾白蝦轉錄組數據進行了微衛(wèi)星標記開發(fā)，根據微衛(wèi)星側翼序列自行設計了269對微衛(wèi)星引物，篩選出3

3、1個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記，并用30尾野生個體進行了驗證，發(fā)現31個位點等位基因數目（Na）為2-9，平均等位基因數為4.19，其中微衛(wèi)星標記ECL03、ECL27具有最多的等位基因數（9個）；平均觀測雜合度（Ho）為0.5787、平均期望雜合度（He）為0.6535，平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.5821，結果表明31個位點中有25個表現為高度多態(tài)，有6個表現為中度多態(tài)。
　　利用上述開發(fā)的25個多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標記分析了

4、本實驗室構建的A、B、C三個回交家系的遺傳結構特征，結果發(fā)現：回交家系A、B、C的平均等位基因數N分別為2.21、2.18、2.09，觀測雜合度Ho分別為0.3805、0.3703、0.2489，期望雜合度He分別為0.3629、0.3998、0.2503，多態(tài)信息含量PIC分別為0.3257、0.3391、0.2585，相較于野生群體已有了大幅度地降低，屬中度或低度多態(tài)；回交家系A、B、C在25個位點上共得到62個等位基因，其中A家系

5、56個，B家系54個，C家系51個，3個回交家系共同存在的等位基因39個，6個位點在回交家系中處于純合狀態(tài)（ECL10在A、B、C中都已純合），計算得出3個回交家系的純合率分別為53.86％、56.53%、63.33%，與野生群體16.91%相比顯著提高，可見回交群體的基因純化速率較快，適用于脊尾白蝦重要經濟性狀的遺傳解析和優(yōu)良種質的選育。
　　2.脊尾白蝦生長性狀相關SNP的開發(fā)及其對回交家系的遺傳特性分析
　　為了發(fā)掘脊

6、尾白蝦與生長性狀相關的SNP位點，本研究基于轉錄組學數據，篩選出生長相關候選基因片段11條，利用該基因序列設計引物進行PCR擴增，得到總長為4579 bp的DNA片段，通過直接測序法發(fā)現49個SNP位點，分布頻率為1.07/100bp，其中轉換突變的比例為78%，顛換突變的比例為22%，符合“transition bias”原理；通過直接測序法在脊尾白蝦野生群體及回交家系中成功分型了7個SNP位點，通過對SNP位點多態(tài)性分析發(fā)現所有SN

7、P位點并未偏離哈伯溫平衡（HWE），SNP標記觀測雜合度（Ho）范圍為0.1667-0.5667，期望雜合度（He）范圍為0.3045-0.5079，上述SNP的MAF遠大于0.05，說明這些SNP位點的多態(tài)性較高，適合進行關聯分析；通過多元方差分析進行關聯分析，發(fā)現2個SNP位點與生長性狀顯著相關（P＜0.05），位點X2-261與體重、體長、腹節(jié)I寬和頭胸甲寬極顯著相關（P＜0.01）；9S-111與體重顯著相關（P＜0.05），該

8、結果有望應用于脊尾白蝦的分子標記輔助育種研究。
　　利用上述7個SNP位點對脊尾白蝦回交家系進行了多態(tài)性分析，結果表明回交家系SNP位點的觀測雜合度（Ho）范圍為0.0333-0.2233，期望雜合度（He）范圍為0.1244-0.3300，與野生群體的雜合度相比都有所降低；7個位點的PIC值較低，這些證明回交家系等位基因的雜合基因型減少，純合基因型增多，使得多態(tài)性降低，這與上述微衛(wèi)星分析的結果相似。同時，我們發(fā)現同一位點不同回交

9、家系間的雜合度并不一致，而相差較大，這可能與回交家系的父母本基因型有關。
　　3.脊尾白蝦TRAF6（TNF receptor associated factor6）基因的克隆及表達分析
　　首次克隆得到脊尾白蝦TRAF6基因，cDNA全長為2290bp，其開放閱讀框為1698bp，編碼566個氨基酸，其中包括TRAF6所特有的四個結構域，分別為RING型鋅指結構、兩個TRAF型鋅指結構、coiled-coil結構域以及MA

10、TH結構域。同源比對表明，脊尾白蝦TRAF6與斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）的同源性最高，達到73%，與凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的同源性次之，達到了72%。利用實時熒光定量PCR分析了TRAF6基因在脊尾白蝦10種組織中的表達分布，發(fā)現其在10種組織中均有表達，在肝胰腺中表達最高，而在殼中的表達量最低，這可能由組織器官功能差異性所致。

11、
　　為了研究TRAF6基因在脊尾白蝦野生群體和回交家系免疫防御中的差異。本研究對脊尾白蝦野生群體及回交家系進行WSSV感染后，利用實時熒光定量PCR分別檢測了肝胰腺和血細胞中TRAF6基因在不同時間點的表達變化規(guī)律。結果表明，病毒感染后TRAR6基因在肝胰腺和血細胞中的表達量在6h后均有明顯的上升趨勢，且在肝胰腺中感染后24 h達到最高值，血細胞中感染后12h達到最高值；對脊尾白蝦野生群體及回交家系TRAR6基因的表達特征進行了