WSSV和干露脅迫條件下脊尾白蝦(Exopalamoncarin cauda)ferritin基因及熱休克蛋白70基因表達(dá)特征.pdf

1、鐵蛋白ferritin基因是機(jī)體生長及免疫相關(guān)的重要功能基因,它具有調(diào)節(jié)鐵代謝平衡、抗氧化細(xì)胞保護(hù)以及腫瘤免疫治療等多種復(fù)雜的生物學(xué)功能,鐵蛋白的研究已成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。熱休克蛋白70是熱休克蛋白家族中的重要成員,是甲殼動(dòng)物最重要的應(yīng)激蛋白之一。目前,關(guān)于鐵蛋白和熱休克蛋白70的研究主要集中在脊椎動(dòng)物上,而對(duì)于無脊椎動(dòng)物,尤其是甲殼動(dòng)物的鐵蛋白的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)以脊尾白蝦為實(shí)驗(yàn)材料,克隆了脊尾白蝦ferritin基

2、因,進(jìn)行了 WSSV感染對(duì)ferritin基因表達(dá)分析,完成了干露脅迫對(duì)脊尾白蝦成活率、ferritin基因及熱休克蛋白70的表達(dá)影響,旨在認(rèn)知脊尾白蝦免疫特點(diǎn)和環(huán)境脅迫下脊尾白蝦的應(yīng)激反應(yīng)。研究分為兩部分:
　　第一部分是以脊尾白蝦為研究對(duì)象,利用RT-PCR以及RACE技術(shù)獲得了總長度為755bp的脊尾白蝦(Exopalamon carincauda)ferritin基因cDNA序列。該基因序列5′和3′的非編碼區(qū)分別為112

3、bp和146bp,開放閱讀框497bp,推測編碼169個(gè)氨基酸。預(yù)測蛋白分子量19.1kDa,等電點(diǎn)5.46,5′-非編碼區(qū)有一個(gè)鐵反應(yīng)元件(iron response element,IRE),該基因命名為Ecfer基因。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與其他甲殼動(dòng)物鐵蛋白氨基酸序列同源性在64％-67%,與脊椎動(dòng)物鐵蛋白H鏈氨基酸序列同源性在53%-57%。利用Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明Ecfer基因氨基酸序列與無

4、脊椎動(dòng)物中的甲殼動(dòng)物聚為一支。運(yùn)用熒光定量RT-PCR研究分析Ecfer基因在組織中表達(dá)分布,以及經(jīng)
　　WSSV感染后血淋巴、肝胰腺中的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ecfer在肝胰腺、卵巢、肌肉、鰓和血淋巴中均有分布,在肝胰腺中表達(dá)量最高,卵巢中表達(dá)量最低。注射WSSV后3h和6h,脊尾白蝦肝胰腺和血淋巴鐵蛋白基因表達(dá)較對(duì)照組都有顯著上調(diào)(P<0.05),并具有顯著的時(shí)間差異性。說明WSSV感染可顯著上調(diào)Ecfer基因的表達(dá),提示

5、了Ecfer基因可能參與了脊尾白蝦抵抗WSSV入侵的免疫反應(yīng),血淋巴在 WSSV感染中表現(xiàn)得比肝臟更敏感。
　　第二部分以脊尾白蝦為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,以C組(干燥低溫)、CG組(干燥常溫)、P組(濕潤低溫)和PG組(濕潤常溫)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組D組進(jìn)行為期12h的干露脅迫實(shí)驗(yàn),記錄12h各實(shí)驗(yàn)組成活率。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法研究了不同干露脅迫條件對(duì)脊尾白蝦血淋巴、肝胰腺及肌肉中ferritin基因和HSP70基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明:

6、(1)保持蝦體濕潤并用冰塊降溫的P組干露脅迫12h后成活率為75%,顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。(2)干露脅迫能上調(diào)P組脊尾白蝦血淋巴、肝胰腺和肌肉ferritin基因的表達(dá),顯著高于對(duì)照組(P<0.05),并且各組織ferritin基因表達(dá)的上調(diào)時(shí)間具有差異性,血淋巴最先上調(diào)。干露脅迫對(duì)C組、CG組和PG組脊尾白蝦各組織ferritin基因表達(dá)具有下調(diào)作用,并顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。(3)干露脅迫能誘導(dǎo)脊尾白蝦血淋巴