病程相關(guān)蛋白基因StPRp27對魔芋軟腐病抗性研究.pdf

1、魔芋為天南星科魔芋屬多年生草本植物，廣泛分布于我國西南山區(qū)，因其球莖富含葡甘聚糖而具有較高的利用價值。魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌屬胡蘿卜軟腐亞種（Erwinia carotovora subsp．carotovora）引起的細(xì)菌性病害，我國大部分魔芋產(chǎn)區(qū)均有此病的發(fā)生，嚴(yán)重時造成魔芋毀滅性災(zāi)害。然而，魔芋中尚未發(fā)現(xiàn)抗軟腐病種質(zhì)資源。病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-related proteins，PR）是植物在病原入侵的病

2、程過程中誘導(dǎo)表達(dá)的一類蛋白質(zhì)，具有廣譜抗病性。但由于病程相關(guān)蛋白是一個龐大的基因家族，家族中不同成員對病原菌的抗性存在一定特異性。病程相關(guān)蛋白基因StPRp27是馬鈴薯病程相關(guān)蛋白基因，屬于PR-17家族。本課題首先對該基因蛋白對魔芋軟腐病菌的抑制作用進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化魔芋，以獲得抗魔芋軟腐病的轉(zhuǎn)基因系，為魔芋抗軟腐病基因工程育種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．StPRp27蛋白對魔芋軟腐病菌具有明

3、顯的抑制作用。將馬鈴薯病程相關(guān)蛋白基因StPRn27亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中，得到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-StPRp27，并將其轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌E．coli菌株BL21（DE3）進(jìn)行原核表達(dá)。不同誘導(dǎo)條件表達(dá)結(jié)果顯示，在IPTG濃度為0.1mM、溫度為22℃時，可以獲得可溶性GST-StPRp27蛋白。進(jìn)一步純化得到了分子量大小約51kd的GST-StPRp27融合蛋白，該蛋白抑菌試驗結(jié)果表明，GST-StPRp27融合

4、蛋白較谷胱甘肽（GST）蛋白具有更強(qiáng)的抑制魔芋軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp．carotovora）生長的效果，隨著濃度的增加抑菌效果增強(qiáng)，當(dāng)GST-StPrp27濃度增加到0.08mM時，病菌基本停止生長，證明StPRp27對魔芋軟腐病菌的生長具有明顯抑制作用。
　　 2．花魔芋轉(zhuǎn)化受體篩選。試管苗形態(tài)學(xué)下部葉柄切段愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100％，且誘導(dǎo)形成的愈傷組織較大；而試管苗形態(tài)學(xué)上部葉柄切段愈傷

5、組織誘導(dǎo)率只有54.4％，誘導(dǎo)形成的愈傷組織也較小；試管苗形態(tài)學(xué)中部葉柄切段愈傷組織誘導(dǎo)能力則介于上部和下部之間。研究還發(fā)現(xiàn)，部分預(yù)培養(yǎng)3周的葉柄切段已經(jīng)誘導(dǎo)形成了愈傷組織，并且葉柄切段間狀態(tài)存在明顯差異；而預(yù)培養(yǎng)兩周的花魔芋試管苗葉柄切段無明顯愈傷組織形成，葉柄切段間狀態(tài)差異亦不明顯。以預(yù)培養(yǎng)2周的葉柄作為轉(zhuǎn)化受體較為適宜。
　　 3．花魔芋轉(zhuǎn)化體系的建立與轉(zhuǎn)基因植株獲得。在以預(yù)培養(yǎng)2周的試管苗葉柄切段為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，