轉(zhuǎn)aiiA基因魔芋的軟腐病抗性及魔芋內(nèi)生菌產(chǎn)生抑菌蛋白的組成分析.pdf

1、本論文共包括兩部分工作，一部分是對(duì)轉(zhuǎn)aiiA基因魔芋（Amorphophallus konjac）的抗病性檢測(cè)；另一部分是對(duì)枯草芽胞桿菌（Bacillus．subtilis）BSn5中新型抑菌蛋白APn5進(jìn)行了雙向電泳以及質(zhì)譜分析，另外，為了尋找APn5的編碼基因，依據(jù)質(zhì)譜分析的結(jié)果，開展了一部分基因敲除的工作。
　　 1．魔芋是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、建筑等領(lǐng)域。但是，魔芋的生產(chǎn)受到軟腐病的嚴(yán)重威脅

2、，其致病菌是胡蘿卜軟腐歐文氏菌。該菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，具有廣泛的寄主范圍，通過細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Quorum sensing system，QS system）來調(diào)節(jié)其致病相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在芽胞桿菌中廣泛存在一種aiiA基因，該基因編碼一種可以降解QS系統(tǒng)中信號(hào)分子?；呓z氨酸環(huán)內(nèi)酯（Acyl-homoserine lactone，AHL）的酶，可通過干擾病原菌的QS系統(tǒng)而減弱其致病性。
　　 本研究中對(duì)34株轉(zhuǎn)

3、aiiA基因的魔芋植株進(jìn)行溫室盆栽種植，同時(shí)進(jìn)行了魔芋抗軟腐病的離體抗病性檢測(cè)，結(jié)果表明魔芋在溫室條件下長(zhǎng)勢(shì)良好，無病蟲害的發(fā)生?？共?shí)驗(yàn)中取不同轉(zhuǎn)基因魔芋植株葉片，分別接種2×106，2×107，2×109cfu胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1，侵染96 h后觀察發(fā)病情況，轉(zhuǎn)aiiA基因植株葉片發(fā)病癥狀較對(duì)照植株均明顯減輕，發(fā)病面積明顯減小，該抗病實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行了兩年，均得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明轉(zhuǎn)aiiA基因魔芋植株獲得了對(duì)軟腐病的顯著抗性，

4、且aiiA基因在魔芋基因組中是穩(wěn)定和可遺傳的。
　　 2．在進(jìn)行魔芋轉(zhuǎn)基因的過程中，從愈傷組織中分離到一株對(duì)魔芋軟腐病菌有抑菌活性的內(nèi)生菌枯草芽胞桿菌BSn5。研究表明BSn5的抑菌活性是由其胞外蛋白Apn5所產(chǎn)生的，該蛋白對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有很好的抑菌活性。為了研究APn5蛋白的性質(zhì)及其編碼基因，利用雙向電泳技術(shù)對(duì)經(jīng)過30％飽和度（NH4）2SO4沉淀、脫鹽、超濾管純化的APn5蛋白進(jìn)行分析，并采用基質(zhì)協(xié)助激光解吸附離子化

5、-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對(duì)所有得到的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了肽質(zhì)量指紋圖譜分析鑒定，Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)。300μg蛋白經(jīng)過雙向凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色后可以檢測(cè)出13個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)主要集中在分子質(zhì)量10-30 kDa區(qū)域，等電點(diǎn)分布于4-5.5之間。MALDI-TOF-MS鑒定了11個(gè)蛋白點(diǎn)。在這些蛋白中，有4個(gè)蛋白點(diǎn)都和鞭毛蛋白表現(xiàn)出相似性，其他點(diǎn)在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)的Mascot分值太低，因而結(jié)果