牛睪丸組織b-Boule基因表達(dá)的甲基化調(diào)控研究.pdf

1、Boule基因是DAZ基因家族成員之一，在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，Boule基因敲除的小鼠精子發(fā)生障礙并最終導(dǎo)致雄性不育。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)電子克隆和克隆測(cè)序獲得了牛DAZ家族基因（b-DAZL和b-Boule），并發(fā)現(xiàn)b-Boule基因在睪丸組織中特異表達(dá)，且黃牛、牦牛睪丸組織中的表達(dá)水平顯著高于種間雜種（犏牛）。目前關(guān)于DAZ家族基因在精子發(fā)生過(guò)程中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控的研究主要集中在DAZL基因上，而關(guān)于Boule基因表

2、達(dá)調(diào)控方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步研究犏牛睪丸組織中b-Boule基因低表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本文擬采用克隆測(cè)序技術(shù)獲得黃牛和犏牛睪丸組織中b-Boule基因啟動(dòng)子區(qū)序列和基因內(nèi)CpG島序列，采用亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)檢測(cè)黃牛和犏牛睪丸組織中b-Boule基因啟動(dòng)子區(qū)和基因內(nèi)CpG島甲基化水平的差異;構(gòu)建啟動(dòng)子區(qū)缺失表達(dá)載體，采用熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)b-Boule基因核心啟動(dòng)子區(qū)的位置;體外甲基化試驗(yàn)驗(yàn)證啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)b-Boule基

3、因表達(dá)的影響，以期從表現(xiàn)遺傳學(xué)角度分析犏牛睪九組織中b-Boule基因低表達(dá)的分子機(jī)制，為闡明犏牛雄性不育的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 1.b-Boule基因的基因組序列分析
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的b-Boule基因cDNA序列，在牛基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，獲得78878bp的黃牛b-boule基因的基因組序列（包括6kb的5'側(cè)翼序列和4kb的3'側(cè)翼序列）。電子染色體定位發(fā)現(xiàn)b-Boule基因定位于2號(hào)染

4、色體，與人BOULE和小鼠Boule基因在染色體間存在高度的保守同線性?；蚪M結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)b-Boule含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)舍子。通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在b-Boule基因5'端存在四個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，分別位于-236bp、-511bp、-725bp和-766bp(以起始密碼子ATG為+1).通過(guò)線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)b-Boule基因存在2個(gè)典型的CpG島:一個(gè)位于5'端，長(zhǎng)度為2229bp，貫穿于5'非編碼區(qū)、笫1外顯子和第1內(nèi)

5、含子，另一個(gè)位于基因內(nèi)部第5和第6外顯子之間，長(zhǎng)度為992bp。
　　 2.b-Boule基因5'調(diào)控序列的克隆與啟動(dòng)子活性分析
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序獲得了黃牛和犏牛b-Boule基因5'端2400bp啟動(dòng)子序列，同源分析發(fā)現(xiàn)，黃牛和犏牛b-Boule基因啟動(dòng)子區(qū)核苷酸序列一致100％。首先，構(gòu)建了4個(gè)雙熒光素酶缺失表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在b-Boule基因-94bp至-364bp范圍內(nèi)存在正調(diào)

6、控元件。為了進(jìn)一步精確b-Boule基因啟動(dòng)子活性中心，在-94bp至-364bp間又構(gòu)建了3個(gè)熒光素酶表達(dá)載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)b-Boule基因核心啟動(dòng)子位于-66bp至-172bp之間，長(zhǎng)度為107bp。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)b-Boule基因啟動(dòng)子區(qū)含有AP-2、Sp-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中Sp1為甲基化敏感位點(diǎn)。
　　 3.黃牛和犏牛睪丸組織b-Boule基因CpG島甲基化分析
　　 采用亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)對(duì)黃牛

7、和犏牛睪丸組織b-Boule基因核心啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在b-Boule基因核心啟動(dòng)子區(qū)含有9個(gè)CpG位點(diǎn)，犏牛睪丸組織中b-Boule基因核心啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平為45.56％(41/90)，極顯著高于黃牛(16.67％，15/90)(P＜0.01)，其中第6-8位CpG位點(diǎn)的甲基化水平差異更明顯（黃牛為13.67％，犏牛為83.33％），結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期睪丸組織mRNA表達(dá)水平和組織學(xué)觀察結(jié)果，推測(cè)啟動(dòng)子甲

8、基化在b-Boule基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，犏牛b-Boule基因核心啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可能與犏牛精子發(fā)生障礙、雄性不育有關(guān)。黃牛和犏牛睪丸組織b-Boule基因內(nèi)CpG島甲基化狀況分析結(jié)果顯示:表明黃牛和犏牛睪丸組織b-Boule基因內(nèi)CpG島DNA甲基化水平差異結(jié)果差異不顯著(P＞0.05)。
　　 4.b-Boule基因啟動(dòng)子區(qū)體外甲基化分析
　　 為了進(jìn)一步研究b-Boule基因核心啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)b-Bo