家蠶繭絲產(chǎn)量相關(guān)基因的挖掘與分析.pdf

1、繭絲性狀是蠶業(yè)生產(chǎn)中非常重要的經(jīng)濟性狀。一頭多絲量實用品種的蠶可生產(chǎn)0.5克以上的絲蛋白，然而種質(zhì)資源庫中很多農(nóng)家品種一頭蠶的泌絲量不足0.1克。傳統(tǒng)的育種技術(shù)是基于表型選擇，而非基因型選擇，效率低下，是近20年國內(nèi)外家蠶育種難以突破的技術(shù)瓶頸。近年來，高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，推進了基因組學和功能基因組學的研究。本研究利用高通量測序技術(shù)比較分析了不同產(chǎn)絲量家蠶絲腺的轉(zhuǎn)錄組，并采用qRT-PCR技術(shù)進行了驗證，挖掘調(diào)控繭絲產(chǎn)量的相關(guān)基因

2、，結(jié)合家蠶基因組精細圖、EST序列以及QTL定位區(qū)域的信息，發(fā)掘影響繭絲產(chǎn)量性狀的關(guān)鍵功能基因。
　　1、絲腺是家蠶絲蛋白合成的重要組織，蠶品種菁松（JS）為多絲量實用品種，而蘭10（L10）為少絲量地方品種。JS的繭層量是L10的5倍左右，而L10的絲膠占繭層的比率是JS的1.2-1.3倍。我們對五齡第三天的JS和L10的絲腺進行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)了1411個差異表達基因（與L10相比，在JS中有738個上調(diào)基因和673

3、個下調(diào)基因）。GO富集分析結(jié)果表明這些差異基因主要富集在9個GO條目中。KEGG Pathway富集分析結(jié)果顯示差異表達基因主要集中在與蛋白生物合成過程相關(guān)的3個通路中。我們對富集通路中的代表基因和10個差異極顯著的基因進行qRT-PCR驗證，驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。這一結(jié)果將有助于挖掘到調(diào)控繭絲產(chǎn)量相關(guān)基因。
　　2、轉(zhuǎn)錄因子是細胞核內(nèi)的一類蛋白因子，通過與順式元件和 RNA聚合酶的相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性，從而間接影響蛋

4、白的合成。在對轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果分析時，發(fā)現(xiàn)部分影響蛋白生物合成相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上有較大差異。應(yīng)用生物信息學的方法篩選到一些差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，最終選取了trx和SGF1并利用qRT-PCR檢查了它們在JS和L10在五齡期間的表達水平，，為下一步功能驗證實驗篩選出候選基因。
　　3、trx基因的功能是與細胞周期和端粒、著絲粒沉默以及基因甲基化有關(guān)，我們推測trx可能是一個抑制或沉默絲蛋白基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，該基因在L

5、10中的表達比JS高，從而可能導致L10的絲蛋白含量少于JS。已有研究表明SGF1是絲蛋白基因通路上游的基因。我們應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和顯微注射的方法，將構(gòu)建的表達trx和SGF1 guide RNA的兩個質(zhì)粒pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA]，分別注射到家蠶的卵中，待到G1代產(chǎn)卵，獲得陽性個體，飼養(yǎng)至G2代，與Cas9品系雜交，后代通過雙熒光篩選兩個轉(zhuǎn)基因家蠶品系，比較了轉(zhuǎn)基因的雙熒光個體與野生型家蠶的全繭量

6、與繭層量，發(fā)現(xiàn)無顯著性差異。
　　4、在比較差異表達基因時，我們找到了一些與絲蛋白相關(guān)基因。相關(guān)資料顯示，這些基因可能位于SGF1轉(zhuǎn)錄因子通路的下游，為研究這些繭絲相關(guān)基因的時空表達差異，采用qRT-PCR技術(shù)，對6個重要的繭絲蛋白基因（FibH,FibL,P25,Ser1,Ser2,Ser3）在五齡期間的表達水平進行了比較分析。結(jié)果顯示JS和L10，從幼蟲5齡至結(jié)繭期間，F(xiàn)ibH,FibL,P25的表達水平的變化趨勢在同一品種中

7、一致，而且在JS中的相對表達量明顯高于L10。然而絲膠相對與絲素基因的表達量即Ser1/FibH的比值卻是L10高于JS，與L10絲膠率比JS絲膠率高的性狀是一致的。
　　本文通過對不同產(chǎn)絲量家蠶品種的絲腺進行轉(zhuǎn)錄組測序比較分析，不但從轉(zhuǎn)錄組的角度鑒定出可能與繭絲產(chǎn)量相關(guān)的主要代謝途徑，并且獲得了大量絲腺差異表達基因的數(shù)據(jù)，對家蠶繭絲產(chǎn)量基因所富集到的相關(guān)通路有了整體的認識。這一研究將會為解析決定繭絲產(chǎn)量的分子機制打下基礎(chǔ)，對于家