家蠶繭絲產(chǎn)量相關基因的挖掘與分析.pdf

1、繭絲性狀是蠶業(yè)生產(chǎn)中非常重要的經(jīng)濟性狀。一頭多絲量實用品種的蠶可生產(chǎn)0.5克以上的絲蛋白，然而種質資源庫中很多農(nóng)家品種一頭蠶的泌絲量不足0.1克。傳統(tǒng)的育種技術是基于表型選擇，而非基因型選擇，效率低下，是近20年國內外家蠶育種難以突破的技術瓶頸。近年來，高通量測序技術的快速發(fā)展，推進了基因組學和功能基因組學的研究。本研究利用高通量測序技術比較分析了不同產(chǎn)絲量家蠶絲腺的轉錄組，并采用qRT-PCR技術進行了驗證，挖掘調控繭絲產(chǎn)量的相關基因

2、，結合家蠶基因組精細圖、EST序列以及QTL定位區(qū)域的信息，發(fā)掘影響繭絲產(chǎn)量性狀的關鍵功能基因。
　　1、絲腺是家蠶絲蛋白合成的重要組織，蠶品種菁松（JS）為多絲量實用品種，而蘭10（L10）為少絲量地方品種。JS的繭層量是L10的5倍左右，而L10的絲膠占繭層的比率是JS的1.2-1.3倍。我們對五齡第三天的JS和L10的絲腺進行了轉錄組測序，結果分析發(fā)現(xiàn)了1411個差異表達基因（與L10相比，在JS中有738個上調基因和673

3、個下調基因）。GO富集分析結果表明這些差異基因主要富集在9個GO條目中。KEGG Pathway富集分析結果顯示差異表達基因主要集中在與蛋白生物合成過程相關的3個通路中。我們對富集通路中的代表基因和10個差異極顯著的基因進行qRT-PCR驗證，驗證結果與轉錄組測序結果一致。這一結果將有助于挖掘到調控繭絲產(chǎn)量相關基因。
　　2、轉錄因子是細胞核內的一類蛋白因子，通過與順式元件和 RNA聚合酶的相互作用來調節(jié)轉錄的活性，從而間接影響蛋

4、白的合成。在對轉錄組測序的結果分析時，發(fā)現(xiàn)部分影響蛋白生物合成相關通路的轉錄因子在轉錄水平上有較大差異。應用生物信息學的方法篩選到一些差異表達的轉錄因子，最終選取了trx和SGF1并利用qRT-PCR檢查了它們在JS和L10在五齡期間的表達水平，，為下一步功能驗證實驗篩選出候選基因。
　　3、trx基因的功能是與細胞周期和端粒、著絲粒沉默以及基因甲基化有關，我們推測trx可能是一個抑制或沉默絲蛋白基因表達的重要轉錄因子，該基因在L

5、10中的表達比JS高，從而可能導致L10的絲蛋白含量少于JS。已有研究表明SGF1是絲蛋白基因通路上游的基因。我們應用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和顯微注射的方法，將構建的表達trx和SGF1 guide RNA的兩個質粒pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA]，分別注射到家蠶的卵中，待到G1代產(chǎn)卵，獲得陽性個體，飼養(yǎng)至G2代，與Cas9品系雜交，后代通過雙熒光篩選兩個轉基因家蠶品系，比較了轉基因的雙熒光個體與野生型家蠶的全繭量

6、與繭層量，發(fā)現(xiàn)無顯著性差異。
　　4、在比較差異表達基因時，我們找到了一些與絲蛋白相關基因。相關資料顯示，這些基因可能位于SGF1轉錄因子通路的下游，為研究這些繭絲相關基因的時空表達差異，采用qRT-PCR技術，對6個重要的繭絲蛋白基因（FibH,FibL,P25,Ser1,Ser2,Ser3）在五齡期間的表達水平進行了比較分析。結果顯示JS和L10，從幼蟲5齡至結繭期間，F(xiàn)ibH,FibL,P25的表達水平的變化趨勢在同一品種中

7、一致，而且在JS中的相對表達量明顯高于L10。然而絲膠相對與絲素基因的表達量即Ser1/FibH的比值卻是L10高于JS，與L10絲膠率比JS絲膠率高的性狀是一致的。
　　本文通過對不同產(chǎn)絲量家蠶品種的絲腺進行轉錄組測序比較分析，不但從轉錄組的角度鑒定出可能與繭絲產(chǎn)量相關的主要代謝途徑，并且獲得了大量絲腺差異表達基因的數(shù)據(jù)，對家蠶繭絲產(chǎn)量基因所富集到的相關通路有了整體的認識。這一研究將會為解析決定繭絲產(chǎn)量的分子機制打下基礎，對于家