黃喉擬水龜cDNA文庫構(gòu)建及MMP-3，VSIG4基因特征分析和表達研究.pdf

1、以致病黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)人工感染的黃喉擬水龜(Maur emysmutica)肝組織為材料，應(yīng)用SMART(switching mechanism at5'end of RNA transcript)技術(shù)，構(gòu)建了黃喉擬水龜?shù)娜LcDNA文庫。首先用SMARTTM PCR cDNAsysthesis kit合成全長的雙鏈cDNA，通過瓊脂糖凝膠分級分離技術(shù)切除小片段的cDNA，將大于500bp的cDNA

2、連接到pGEM-T載體中，電轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞。在構(gòu)建好的文庫中，經(jīng)測定，文庫約含有1.8×105個重組子，重組效率達90％，插入片段多在0.5kb～3kb之間。對庫中長度約為1000bp的80個基因進行了測序，結(jié)果顯示大部分在龜類首次發(fā)現(xiàn)。測序鑒定的基因包括免疫相關(guān)基因9個：轉(zhuǎn)鐵蛋白基因，補體C3基因，補體C9基因，血清蛋白基因，巨噬細胞炎癥蛋白基因，血清淀粉樣蛋白A基因，血漿銅藍蛋白基因，α-2巨球蛋白基因和VSIG4;信號

3、傳導(dǎo)基因6個：RAS原癌基因，死亡相關(guān)蛋白基因，血管緊張素原基因，HIG1家族基因，鋅指蛋白基因和disabled homolog2；催化酶類基因6個：?；o酶A合成酶基因，酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，乙醛脫氫酶基因，氨基乙二酸半醛合成酶基因，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶基因，賴氨酸羥化酶基因；糖代謝相關(guān)基因2個：金屬基質(zhì)蛋白酶3基因和金屬基質(zhì)蛋白酶23基因；轉(zhuǎn)運相關(guān)基因1個：可溶性載體家族基因；結(jié)構(gòu)基因2個：delta-tubulin和

4、beta-actin(ACTB)，等等。本研究構(gòu)建成的黏質(zhì)沙雷氏菌誘導(dǎo)的黃喉擬水龜全長cDNA文庫構(gòu)建成功，為免疫基因全長序列的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 利用本實驗室構(gòu)建的黃喉擬水龜SMART全長cDNA文庫，篩選得到編碼MMP-3全長cDNA(命名為MaMMP3), MaMMP3基因cDNA全長1806bp,5’非編碼區(qū)(Untranslatedregion, UTR)長57bp,3'UTR長243bp，開放閱讀框(Open r

5、eading frame, ORF)為1506bp，編碼481個氨基酸組成的多肽鏈，分子量為55.15kDa，理論等電點為5.86。該多肽鏈由信號肽(20AA)，前體域(83AA)和成熟域(164AA)和C-末端(189AA)四部分組成。前肽結(jié)構(gòu)域中存在著高度保守的氨基酸序列：PRCGVPD。催化結(jié)構(gòu)域中含有一段十分保守的氨基酸序列：HEXXHXXGXXH，其中三個組氨酸與活性中Zn2+形成配位鍵，對酶的催化起重要作用。C-末端區(qū)為血紅

6、素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，通過鉸鏈區(qū)與催化結(jié)構(gòu)域相連，是MMP-3與底物相結(jié)合的部位。同源性分析表明，MaMMP3氨基酸序列與其他物種高度保守，相似性介于39-77％之間，一致性介于25-63％之間。進化分析顯示，黃喉擬水龜MMP-3與原雞(Gallus gallus)和珍珠雞(Taeniopygiaguttata)MMP-3親緣關(guān)系最近。在MaMMP3基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，擴增得到其基因組DNA序列5708.bp，這個MMP-3序列包括8

7、個外顯子和7個內(nèi)含子，各個內(nèi)含子的剪切供體或受體處都有“GT/AG”序列特征。組織表達實驗表明，MaMMP3在脾臟、肝臟、腎臟、心臟中均表達，脾臟表達量最高。應(yīng)激實驗表明，在黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)刺激下，MaMMP3基因脾臟、肝臟中的表達量顯著上調(diào)。將MaMMP3的開放式閱讀框插入pET32a表達載體T7啟動子控制下的6-His·Tag編碼基因上游，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET32a-MMP3表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿

8、菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達pET32a-MMP3融合蛋白。這些結(jié)果為探索MMP-3在黃喉擬水龜非特異性免疫反應(yīng)中的作用提供了重要信息。
　　 篩選得到編碼VSIG4全長cDNA(命名為MaVSIG4)。MaVSIG4 cDNA全長1841bp,5’非編碼區(qū)( Untranslated region, UTR)長332bp,3'UTR長327bp，開放閱讀框(Openreading frame, ORF)為

9、1182bp，編碼372個氨基酸(AA)組成的多肽鏈，分子量為41.77kDa，理論等電點為8.83。該多肽鏈由一個信號肽序列(19AA)，兩個Ig結(jié)構(gòu)域(109AA和83AA)和一個跨膜結(jié)構(gòu)域(23AA)組成。同源性分析表明，MaVSIG4氨基酸序列與其他物種相比對，相似性介于31-66％之間，一致性介于17-48％之間。進化分析顯示，MaVSIG4和原雞(Gallus gallus)親緣關(guān)系最近。在MaVSIG4基因cDNA序列的基

10、礎(chǔ)上，擴增得到其基因組DNA序列7024bp，這個MaVSIG4序列包括6個外顯子和5個內(nèi)含子，各個內(nèi)含子的剪切供體或受體處都有“GT/AG”序列。組織表達實驗表明，MaVSIG4在肝臟、脾臟、心臟和腎臟中均表達，肝臟表達量最高。應(yīng)激實驗表明，在黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)刺激下，MaVSIG4基因在12h肝臟、心臟、腎臟中的表達量顯著下降。到24h和36h表達量又開始回復(fù)。MaVSIG4的開放式閱讀框插入pE