菊花花器官cDNA文庫的構建及DgGA20ox基因克隆與表達分析.pdf

1、菊花原產我國，是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有很高的觀賞和應用價值，在花卉生產中占有十分重要的地位。但菊花新基因的發(fā)掘和分子育種方始起步，本研究在構建菊花花器官EST文庫，分析其花序開放過程基因表達譜基礎上，對GA20-氧化酶基因新基因進行了克隆與表達分析。主要結果如下：
　　 1.首次以菊花特定發(fā)育階段的花器官為植物材料，利用pBluescript XR載體構建了一個菊花花器官cDNA文庫，文庫滴度為1.8×107

2、pfu/ml，擴增后文庫滴度達9.O×1011pfu/ml。經過藍白斑計數(shù)，文庫的重組率可達90％。平均插入片段大小為1-2kb左右，說明所構建的文庫完全符合目的基因分離篩選和表達建庫的要求。通過4個花器官優(yōu)勢表達基因的半定量PCR分析，均發(fā)現(xiàn)在花器官中的表達量較高，說明該文庫具有代表性和有效性，可為進一步開展與菊花發(fā)育相關基因的克隆及花器官發(fā)育分子機理的探討等研究奠定重要的基礎。
　　 2.在構建的cDNA文庫中隨機挑選了7,

3、500個克隆進行5’端測序，共獲得7,307條原始序列。原始序列經去除插入片段小于100bp和污染序列后，共得到6,924條高質量的EST序列，平均GC含量為43.5％，序列遞交DDBJ數(shù)據庫(登錄號：DK936567-DK943490);CAP3程序拼接ESTs得到4,563個Unigenes，其中包括996個contigs和3,567個singlets，冗余度為34.1％。通過序列比對注釋，發(fā)現(xiàn)有57.2％的Unigenes(2,6

4、08)能夠通過注釋進行功能分類，而42.8％的Unigenes(1,955)不能比對上現(xiàn)有數(shù)據庫中的任何蛋白質或核酸序列，推測1，955個Unigenes可能是有一些已知基因的非編碼區(qū)序列，也有可能是一些功能未知的新基因。
　　 3.所得到的EST序列中，編碼RuBP羧化酶小亞基的EST數(shù)量最多，說明rbcs基因在該cDNA文庫中的表達量較高。26.7％的Unigenes(1,217/4,563)可以通過COG聚類，其中最高14

5、.79％的Unigenes(180/1,217)編碼轉錄后修飾、蛋白轉運相關的酶，而與防衛(wèi)機制以及細胞運動性相關的Unigenes最少。在所有的6,924條高質量ESTs序列中，35.1％能比對上擬南芥的ESTs,27.2％的序列比對上了水稻的ESTs序列，與菊科植物向日葵、萵苣、非洲菊、百日草的ESTs序列相比較，分別有82.0％、64.6％、48.8％和24.4％的序列能比對上。同時，在6,924條ESTs中，有131個ESTs編碼

6、推測的轉錄因子，占整個Unigenes的2.78％(131/4,563)。其中表達量最高的是C3H轉錄因子家族，占全部轉錄因子ESTs的16.0％(21/131)；在4,563個Unigenes中，我們找到了6個已知的花發(fā)育相關基因和10個與花色素合成代謝相關的基因。
　　 4.在菊花花器官cDNA文庫的EST序列中，找到一條與GA20-氧化酶基因同源的EST(克隆號：rfchcaa0_007176)。挑選該克隆進行雙向測序，并

7、進行3’、5’ RACE-PCR得到1,543bp的全長菊花GA20-氧化酶基因cDNA序列（DgGA20ox,AB360381），具有一個1,134bp的ORF，編碼377個氨基酸及103bp的5’非編碼區(qū)和306bp包含了多聚A尾的3’非編碼區(qū)。與其相應的基因組DNA序列(1,468bp,AB360434)比對后發(fā)現(xiàn)，該基因基因組DNA序列中包含了90bp和234bp的內含子。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，其具有GA20-氧化酶所特有的依

8、賴2-酮戊二酸的雙加氧酶特性的保守序列，如與2-酮戊二酸結合有關的保守序列NYYPXCQKP，與GA底物結合有關的LPWKET基元以及可能與Fe2+結合有關的His殘基（H246和H302）和Asp殘基(D248),并與同科植物萵苣的Ls20ox1氨基酸序列有87％的同源性，確定為菊花的GA20-氧化酶基因。Southern雜交表明，該基因在菊花中存在多個同源拷貝。
　　 5.熒光定量PCR結果表明，DgGA20ox基因在菊花的

9、嫩葉中表達量最高，其次是莖和花中，根中的表達量最少，說明嫩葉可能是菊花活性GA生物合成的主要位點；在菊花頂芽中，DgGA20ox基因在一天中的表達呈規(guī)律性起伏，在黑暗條件下的轉錄水平比在光照條件下高，且在光照結束后4h表達量最高。外源激素處理證明了DgGA20ox基因的表達受活性GA的反饋抑制調控，內源GA含量高時，DgGA20ox基因的表達受抑制；內源GA生物合成受阻抑時，DgGA20ox基因的表達量升高，同時內源的IAA含量也升高，

10、說明IAA在GA的生物合成中有重要作用。
　　 6.構建DgGA20ox基因正義表達載體，采用農桿菌介導的葉盤法進行遺傳轉化，通過PCR和Southern雜交鑒定，有3個株系整合進了外源DgGA20ox基因。表型觀察發(fā)現(xiàn)轉基因植株較對照矮化，葉片小，生長勢弱；進而進行DgGA20ox基因的表達分析及內源GA含量測定，發(fā)現(xiàn)轉基因植株中無論是DgGA20ox基因的表達量還是內源GA含量都明顯低于對照，推測轉基因植株可能出現(xiàn)了共抑制的