椪柑花器官和幼果的cDNA文庫構(gòu)建及EST分析.pdf

1、以cDNA文庫為基礎(chǔ)的ESTs(Expressed Sequence Tags，表達序列標簽)技術(shù)是一種快速進行基因功能分析及發(fā)現(xiàn)新基因的方法。為了開展我國特色椪柑的基因發(fā)掘研究，本文構(gòu)建了椪柑花和幼果的cDNA文庫，并以該文庫為材料進行5'端EST測序和生物信息學分析。主要結(jié)果如下：
　　 1、以改良的異硫氰酸胍法從椪柑花和幼果中提取總RNA，分離純化富含PolyA的mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，通過CHROMA

2、S PIN-400柱篩選出其中大于500bp的片段與載體pDNR-LIB連接，最后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌ElectroMAXDH5a，構(gòu)建了椪柑花和幼果的cDNA文庫。經(jīng)質(zhì)量檢測，初級文庫的庫容為1.13×108個/mL，符合高質(zhì)量文庫的要求。文庫的重組率為97％，且插入片段的長度在0.5-2.5kb之間，說明文庫完整、有效，可用于大規(guī)模EST序列測定及數(shù)據(jù)分析。
　　 2、從椪柑花和幼果cDNA質(zhì)粒文庫中隨機選取503個克隆進行

3、測序，經(jīng)CAP3軟件編輯后，獲得長度大于100bp的有效序列為487條，其序列的平均長度為522bp，序列平均質(zhì)量數(shù)為36.25；另外通過GC含量分析獲得EST的GC含量為40.49％。利用CAP3軟件對487條有效EST序列進行片段重疊群分析和拼接后共獲得298個獨立基因(Unigene)，其中包括27個片段重疊群(Contig)和271個獨立的ESTs(Singlet)。
　　 3、將獨立基因(Unigene)以GeneOn

4、tology進行功能分類。按照GO的分子功能、生物過程和細胞組分三個不同分類角度分類，把通過BlastX比對獲得椪柑有功能描述基因(包括功能確定的及推測功能的)分為11類，即代謝相關(guān)基因(Metabolism)占功能描述基因的21.02％、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因(Protein synthesis)占功能描述基因的19.89％、能量代謝相關(guān)基因(Energy)占8.52％、細胞內(nèi)運輸相關(guān)基因(Transporters)占9.09％、轉(zhuǎn)錄相關(guān)

5、基因(Transcription)占14.20％、信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因(Cellular signal transduction)占4.55％、細胞生長發(fā)育相關(guān)基因(Cell growth anddivision)占3.98％、細胞抗性及防御相關(guān)基因(Disease and defence)占8.52％、細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因(Cell structure and Cellcycle)占3.41％、次生代謝相關(guān)基因(Secondarymetabo