巨噬細胞特異表達共刺激分子VSIG4對腎小管間質(zhì)損傷的保護作用.pdf

1、背景與目的：
　　 腎小管間質(zhì)損害是各種終末期腎病的共同通路，其病變程度與慢性腎病患者預(yù)后密切相關(guān)。腎小管間質(zhì)的損害是以間質(zhì)炎細胞浸潤為主要特征，其中尤其以T細胞、巨噬細胞的浸潤和活化最為關(guān)鍵。這些浸潤的炎性細胞通過分泌炎癥因子可激活局部炎癥反應(yīng)，進而引起小管間質(zhì)損害和纖維化。有效減輕腎小管間質(zhì)炎癥及纖維化反應(yīng)，對減緩腎臟病變向終末期腎臟疾病發(fā)展具有尤為重要的意義。
　　 共刺激分子是一類細胞膜表面分子，可分別為T、B細

2、胞的活化提供必要的輔助信號，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、活化及分化。近年來在腎臟疾病的實驗研究中，通過對CD28、CD40和ICOS等共刺激途徑的抑制來間接誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞的無能，以達到減少腎組織損傷的目的，已經(jīng)取得了一定的效果。VSIG4(V-set and immunoglobulindomain-containing protein 4)又稱補體受體Ig 超家族分子(Complement receptor of theimmunoglobu

3、lin superfamily，CRIg)，或Ig 超家族蛋白-39(Ig superfamily protein 39,Z39Ig)，為I 型跨膜分子，是新近鑒定的對T細胞的活化和存活具有重要調(diào)節(jié)作用的B7家族共刺激分子。VSIG4 主要表達在單核來源的巨噬細胞上，在成人體內(nèi)單核巨噬細胞主要分布的組織如肝、肺等均有VSIG4mRNA的表達。近期研究顯示，VSIG4 可交聯(lián)其尚未知的受體分子抑制T細胞活化，發(fā)揮共抑制分子配體的功能。前期

4、在對腎病患者腎活檢標本的研究中發(fā)現(xiàn)所有標本均有不同程度的T細胞浸潤，而T細胞周圍有豐富的巨噬細胞；該群巨噬細胞特異表達VSIG4，且VSIG4 主要表達在小管間質(zhì)損傷輕的區(qū)域。我們推測巨噬細胞表達的VSIG4 發(fā)揮共刺激分子配體的作用，通過與T細胞表面尚未知的受體作用，抑制T細胞的活化，降低T細胞炎癥因子分泌，減低T細胞對鄰近細胞的活化，從而改善腎間質(zhì)炎癥及纖維化的病理進程。
　　 本試驗擬采用VSIG4基因敲除(VSIG4-/

5、-）小鼠及VSIG+/+小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻(UnilaterAlureterAlocclusion，UUO)模型，通過比較兩組腎小管間質(zhì)損傷程度及體內(nèi)T細胞、巨噬細胞功能的差異，探討VSIG4對腎小管間質(zhì)損傷的治療作用及其機制。為腎間質(zhì)炎癥及纖維化的防治尋找新的思路。方法：
　　 SPF級雄性C57B6(VSIG4-/-及VSIG4+/+）小鼠共40只，其中VSIG4-/-組、VSIG4+/+組小鼠各20只，兩組小鼠分別行左

6、側(cè)輸尿管結(jié)扎，建立單側(cè)輸尿管梗阻(UnilateralureterAlocclusion，UUO)模型，并分別于假手術(shù)對照組、術(shù)后3、7、14天取小鼠左腎(每個時相點各5只小鼠，對照組剖腹不結(jié)扎)，HE 染色觀察左側(cè)腎臟腎小管損傷及間質(zhì)炎性細胞浸潤程度，生化指標檢測小鼠血肌酐、尿素氮，免疫組化觀察腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrixmetal

7、loproteinase 2，MMP-2)、CD3+T細胞及CD68+巨噬細胞，免疫熒光觀察CD3+、CD4+及CD8+T細胞變化情況，Real-time PCR 觀察白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α）、γ-干擾素(Interleukin-γ，IFN-γ）、白細胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)的表達，比較兩組之間

8、的差別，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果顯示：
　　 ①IL-2 mRNA在VSIG4+/+組術(shù)后表達量增加(p＜0.05)，術(shù)后14天表達量達高峰；
　　 在VSIG4-/-組術(shù)后表達量也增加(p<0.05)，術(shù)后14天達高峰。VSIG4-/-組IL-2在術(shù)后3天、14天表達較VSIG4+/+組相同時相點表達增多。
　　 IFN ②-γ mRNA在VSIG4-/-及VSIG4+/+組術(shù)后腎組織中均有表達，

9、術(shù)后7天、14天VSIG4+/+組IFN-γ表達量較術(shù)后3天明顯增加(p<0.01)；術(shù)后7天、14天VSIG4-/-組IFN-γ表達也較術(shù)后3天增加(p<0.05)。VSIG4-/-組術(shù)后IFN-γ表達較VSIG4+/+組相同時相點表達明顯增多(p<0.01)。
　　 IL ③-10mRNA在VSIG4+/+組腎組織隨梗阻時間延長表達量逐漸增加(p<0.05)，同樣在VSIG4-/-組術(shù)后IL-10隨梗阻時間延長表達量也逐漸增

10、加(p<0.01)。但IL-10mRNA在VSIG4-/-組術(shù)后14天表達較VSIG4+/+組相同時相點表達明顯減少。
　　 TNF ④-αmRNA在VSIG4+/+組術(shù)后3天腎組織中的表達與對照組無明顯差別(p＞
　　 0.05)，術(shù)后7天表達開始增加；在VSIG4-/-組TNF-α的表達隨梗阻時間延長而逐漸增加(p＜0.05)。VSIG4-/-組TNF-α術(shù)后7天、14天表達較VSIG4+/+組同期表達增多(p<0.

11、05)。
　　 5、免疫熒光檢測結(jié)果顯示：VSIG4+/+組腎組織中術(shù)后CD3+、CD4+、CD8+T細胞均隨梗阻時間延長表達逐漸增加；在VSIG4-/-組表達趨勢同VSIG4+/+組術(shù)后；然而，在VSIG4-/-組術(shù)后表達較同期VSIG4+/+組表達上調(diào)。免疫組化檢測結(jié)果顯示：VSIG4+/+組術(shù)后CD68+巨噬細胞隨梗阻時間延長表達增加，術(shù)后7天達高峰，在VSIG4-/-組中表達趨勢相同，但VSIG4-/-組術(shù)后表達與同期V

12、SIG4+/+組表達無顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實驗成功制備VSIG4+/+及VSIG4-/-單側(cè)輸尿管梗阻小鼠動物模型。
　　 2.vsIG4-/-組小鼠術(shù)后腎間質(zhì)炎細胞浸潤及小管損傷重于VSIG4+/+組小鼠。提示VSIG4 可抑制單側(cè)輸尿管梗阻小鼠的腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和腎間質(zhì)纖維化。
　　 3.在VSIG4+/+組腎組織中TGF-β1表達隨梗阻時間延長進行性增加；MMP-2表達在術(shù)后3天達峰