體外重建HLAⅠ類(lèi)分子鑒定SARS-COV T細(xì)胞表位的初步研究.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是位于哺乳動(dòng)物某一染色體上的一組緊密連鎖的基因群,是參與抗原提呈和T細(xì)胞激活的關(guān)鍵分子。嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)是一種高致病性、高流行性和高死亡率的新型人類(lèi)傳染疾病。MHC-肽復(fù)合體技術(shù)可在體外對(duì)SARS-CoV抗原表位進(jìn)行鑒定,并可對(duì)疫苗進(jìn)行初步且可靠的評(píng)價(jià)。對(duì)SARS-CoV S蛋白進(jìn)行的抗原表位預(yù)測(cè)表明其存在有能夠同人MHC(HLA)分子較高親和力結(jié)合的抗原表位,暗示這一區(qū)域?qū)τ诖碳C(jī)體產(chǎn)生免疫

2、應(yīng)答具有重要作用。本研究通過(guò)體外重建HLA I類(lèi)分子復(fù)合體對(duì)SARS-COV S蛋白的4條T細(xì)胞抗原表位肽進(jìn)行鑒定。主要內(nèi)容包括:
　　 1.參照GenBank發(fā)表的HLA-Aα鏈成熟肽胞外區(qū)和β2m成熟肽基因序列,分別設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物,提取外周靜脈血總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后分別克隆到pGEM-T Easy載體上并測(cè)序。結(jié)果顯示α鏈胞外區(qū)成熟肽基因全長(zhǎng)819 bp,編碼273個(gè)氨基酸,分子量為31.45 KDa,其中

3、疏水氨基酸26.53％,親水氨基酸28.83％,與Genbank中所參照的HLA-A成熟肽基因序列(NM002116)的同源性為93％。經(jīng)與牛、雞、狗、鴨、青蛙、鵝、草魚(yú)、馬、鼠、猩猩、鵪鶉、獼猴、豬等的MFlC I a成熟肽胞外區(qū)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,其核苷酸同源性分別為76.9％、38.5％、81.9％、39.1％、31.4％、39.3％、29.7％、81％、68.1％、83.5％、39.5％、81％、76.6％。β2m成熟肽基因全

4、長(zhǎng)297 bp,共編碼99個(gè)氨基酸,分子量為11.73KDa,其中疏水氨基酸28.15％,親水氨基酸29.24％,與GenBank中所參照的人β2m成熟肽基因序列(NM004048)的同源性為100％。與牛、雞、魚(yú)、獼猴、鼠、鴨嘴獸、猩猩、羊等的β2m成熟肽基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性分別為73.5％、45.5％、47.4％、90.9％、69.7％、53.6％、100％、73.5％。
　　 2.為了獲取HLA-A a鏈成熟肽胞

5、外區(qū)和B2m成熟肽蛋白質(zhì)分子,分別合成1對(duì)引物,將編碼HLA-Aα鏈和p2m胞外區(qū)成熟肽基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28 a(+)中,成功獲得了重組質(zhì)粒pET-28/HLA-Aa和pET-28/HLA-β2m；構(gòu)建成功的基因工程大腸桿菌經(jīng)適宜濃度的IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析α鏈胞外區(qū)和β2m成熟肽基因分別在31-45KDa和11.73KDa處出現(xiàn)大量表達(dá),且表達(dá)情況表明,a鏈胞外區(qū)和β2m成熟肽基因在重組大腸桿菌中均

6、以包涵體形式得到了高效穩(wěn)定的表達(dá),且包涵體純度均達(dá)到90％以上。
　　 3.為體外重建HLA I類(lèi)分子,并利用其鑒定了感染人的T細(xì)胞表位,我們預(yù)測(cè),設(shè)計(jì)合成了SARS-CoV S蛋白的4條抗原表位肽:SP1(QIAPGQTGW)、SP2(VIADYNYKL)、SP3(VLAWNTRND、SP4(Kt,RPFERDI)。運(yùn)用表達(dá)的HLA-Aa鏈成熟肽胞外區(qū)蛋白和HLA-β2m成熟肽蛋白與各個(gè)9肽分別按照1:1:3的摩爾比共復(fù)性。非