凡納濱對蝦抗脂多糖因子ALF-AVK基因的克隆及其特性研究.pdf

1、甲殼動物在水產養(yǎng)殖業(yè)中占據十分重要的地位，特別是上世紀80年代以來興起的對蝦養(yǎng)殖行業(yè)，給我國沿海地區(qū)帶來了可觀的經濟效益，但在養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大的同時，各種疾病的爆發(fā)也給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了較多的困擾和巨大的經濟損失。近年來，隨著對蝦病害與免疫學研究的深入，許多免疫相關因子的基因序列和功能得到了深入的研究和了解?？怪嗵且蜃?Anti-lipopolysaccharide factors,ALF)在甲殼動物固有免疫防御體系的識別和清除病原菌功

2、能中起著重要的作用，對其深入的研究有助于甲殼動物疾病的防御和控制。在本論文的研究中，以凡納濱對蝦為材料，圍繞其ALF（ALF-AVK）基因的克隆與其蛋白的特性分析展開了研究，主要包括以下幾方面；
　　1.根據NCBI中一段類似ALF的EST序列設計引物，利用RACE技術克隆得到了凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）的一段ALF序列并根據其蛋白序列特有的丙氨酸-纈氨酸-賴氨酸3個特別的氨基酸序列定名為ALF-AVK序

3、列，該序列全長705bp，含有一個43bp的5'端非編碼區(qū)（UTR），之后為396bp的開放閱讀框（ORF），3'端包含有293bp的多聚賴氨酸的尾巴。ALF-AVK基因編碼122個氨基酸組成的蛋白序列，分子量約為13.7kDa，等電點為9.95。
　　2.利用熒光定量PCR分析了ALF-AVK在凡納濱對蝦六種不同組織的轉錄水平發(fā)現，該基因在血細胞中轉錄水平最高，其次為鰓和心臟，而在肌肉、肝胰腺以及腸中轉錄處于較低的水平。同樣利用

4、qPCR技術對作為對蝦體內主要免疫防御器官的血細胞在經過對蝦白斑癥病毒和鰻弧菌刺激之后ALF-AVK基因的轉錄水平變化做了研究。WSSV感染之后該基因可能由于應激作用在6h前轉錄水平會有一定量的升高，之后開始下降知道24h恢復正常水平，而之后隨著WSSV的復制其轉錄水平又會出現上升直到96 h。在鰻弧菌感染組，ALF-AVK的表達量會逐漸上升直到12h到達最高峰，之后緩慢下降直到96h。
　　3.構建了pET-30a-ALF的原核

5、表達載體，并對其進行了原核表達。使用IPTG誘導法對重組蛋白rALF-AVK進行大量誘導表達，用His標簽親和層析柱對其進行了純化。使用純化rALF-AVK蛋白免疫Balb/C品系小鼠后制備了多克隆抗體血清，經Western blotting檢測發(fā)現多抗血清可以識別分子量為21kDa的重組蛋白并可在鰻弧菌及WSSV感染之后的對蝦血細胞總蛋白14kDa的預期位置上檢測到特異性條帶條帶。
　　4.利用間接酶聯免疫反應（ELISA）和細

6、菌-蛋白結合沉淀反應兩個實驗驗證了ALF-AVK重組蛋白與革蘭氏陰性鰻弧菌(Vibrioanguillarum)的結合活性。ELISA結果顯示隨著rALF-AVK蛋白濃度的增加，吸光值也會相應增加，而細菌-蛋白結合沉淀實驗顯示鰻弧菌與rALF-AVK孵育之后的沉淀樣品中含有重組蛋白。為了驗證ALF是否會參與鰻弧菌與WSSV感染對蝦的過程，我們還進行了對蝦體內中和反應的實驗，結果顯示鰻弧菌與rALF-AVK孵育之后會對對蝦的死亡率有一定的

7、推遲作用，而WSSV與rALF-AVK的孵育對死亡率并沒有明顯的影響。上述的實驗結果證明rALF-AVK對鰻弧菌有一定的結合活性。
　　5.以純化的ALF-AVK重組蛋白為抗原制作的鼠源多抗血清為一抗，采用石蠟切片、免疫組化技術，研究了ALF在凡納濱對蝦血細胞、鰓、心臟、腸和肝胰腺等組織器官中的分布特點。結果表明：ALF主要表達并存在于血細胞中，在鰓絲小葉邊緣微血腔、心肌束間隙、肝小管間隙以及腸壁邊緣有陽性信號出現。結論認為凡納濱