AFP、CBF2基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、低溫是限制植物分布與生長(zhǎng)的重要因素，低溫傷害是一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，全球每年因此造成農(nóng)作物的損失高達(dá)數(shù)千億美元。苜蓿（Medicago sativa）為暖溫帶重要的牧草，對(duì)溫度反應(yīng)敏感。低溫是制約其生長(zhǎng)的主要限制因子，如何提高苜蓿的抗寒性對(duì)提高其生產(chǎn)力有重要的意義，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行植物抗凍性分子改良具有高效性和針對(duì)性。本研究成功地從胡蘿卜和擬南芥中克隆了抗凍蛋白基因AFP和抗凍基因CBF2，并分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體并將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌中

2、；還針對(duì)目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法中存在的轉(zhuǎn)化率低的問題，對(duì)苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化：已通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的AFP、CBF2抗凍基因植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到了優(yōu)良苜蓿品種中。主要成果如下：
　　 ⑴分別以胡蘿卜和擬南芥基因組DNA為模板，通過PCR方法，成功地克隆了全長(zhǎng)1200bp的抗凍蛋白基因AFP和全長(zhǎng)700bp的抗凍基因CBF2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，采用IPTG誘導(dǎo)，使宿主菌重組子表達(dá)特異的抗凍基因。
　　

3、 ⑵通過雙酶切，將其分別連接到PBI121工程質(zhì)粒上，成功地構(gòu)建了含有卡那霉素抗性選擇標(biāo)記的植物表達(dá)載體P-T-AFP和P-T-CBF2，并通過直接轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。
　　 ⑶遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。以培養(yǎng)7天的和田苜蓿的無菌苗子葉為外植體，以農(nóng)桿菌菌株為介體，預(yù)培養(yǎng)3天，侵染時(shí)間為10min，菌液濃度OD600=0.3，共培養(yǎng)3天，Kan篩選濃度定為60mg/L，脫菌過程中使用400mg/L的羧芐青霉素。