雙孢蘑菇栽培基質(zhì)中放線菌的分離鑒定及特性研究.pdf

1、在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中每年產(chǎn)生大量的作物秸稈，由于其主要成分—纖維素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及存在狀態(tài)的特殊性，難以得到有效利用。近年來(lái)迅速發(fā)展的食用菌產(chǎn)業(yè)對(duì)農(nóng)作物秸稈的利用發(fā)揮了重要作用，可用來(lái)生產(chǎn)雙孢蘑菇、雞腿菇、大球蓋菇等多種食用菌。雙孢蘑菇是能利用秸稈的草腐型食用菌之一，在經(jīng)過(guò)堆積發(fā)酵的栽培基質(zhì)上產(chǎn)生子實(shí)體，子實(shí)體產(chǎn)量及品質(zhì)與堆積發(fā)酵程度相關(guān)。本論文在經(jīng)過(guò)一次堆積發(fā)酵的雙孢蘑菇栽培基質(zhì)中篩選到3株放線菌LLJ-03、LLJ-04、LLJ-05，根據(jù)培

2、養(yǎng)特征、16S rDNA序列及生理生化特征分別鑒定為Streptomyces griseorubens LLJ-03、Streptomyces fungicidicus LLJ-04、Nocardioides thermolilacinusLLJ-05。
　　S.griseorubens LLJ-03在麥草等秸稈類(lèi)基質(zhì)上生長(zhǎng)良好，可以加速其生物轉(zhuǎn)化。采用DNS法測(cè)定了發(fā)酵過(guò)程中羧甲基纖維素酶活力的變化:(1)在液體發(fā)酵過(guò)程中，酶活

3、力在70U/ml至100U/ml區(qū)間呈波形變化，表明此酶活力較為穩(wěn)定。在第24h酶活力為83.9 U/ml，第48h升高至85.3U/ml，在第72h又降低至73.0U/ml，之后于第120h升至96.4U/ml，然后小幅下降，于第192h升高至96.8U/ml后，再次下降；(2)在固體發(fā)酵過(guò)程中，第120h左右羧甲基纖維素酶活力達(dá)最高值484.7 U/ml。在液體發(fā)酵過(guò)程中，第24h時(shí)還原糖含量為5。12mg/ml，第48h時(shí)為5.1

4、7 mg/ml，于第72h稍微降低至4.71 mg/ml后持續(xù)增加，隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加速率降低，還原糖總量趨于穩(wěn)定，總體穩(wěn)定在7.00 mg/ml左右。
　　S.fungicidicus LLJ-04和N.thermolilacinus LLJ-05對(duì)供試的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f。sp。cucum erinum)、赤霉病菌(Fusarium gram

5、inearum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f。sp。niveurn)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、鏈孢霉(Neurospora crassa)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)7種病原真菌均具有不同程度的拮抗作用。通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)、菌種塊抑制菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)、菌絲有機(jī)溶劑提取液抑制鏈孢霉生長(zhǎng)試驗(yàn)、菌絲有機(jī)溶劑提取液抑制孢子萌發(fā)試驗(yàn)表明:(1)鏈霉菌菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了一些

6、抗真菌物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)不同病原真菌生長(zhǎng)的抑制程度不同，對(duì)供試食用菌的抑制作用甚微；(2)所產(chǎn)生的抗病原真菌物質(zhì)主要存在于菌絲體內(nèi)，使用甲醇等極性較大的有機(jī)溶劑提取得率較高；(3)菌絲有機(jī)溶劑提取液中的抗菌物質(zhì)能夠抑制鏈孢霉菌絲生長(zhǎng)和供試病原真菌孢子萌發(fā)，對(duì)不同真菌孢子的抑制作用不同。
　　通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，S。fungicidicus LLJ-04和N。thermolilacinus LLJ-05在發(fā)酵240h以后對(duì)病原真菌的抑

7、制率達(dá)到峰值，其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的速率不同，S.fungicidicus LLJ-04菌絲成熟后分泌抗菌物質(zhì)的速率快，7天就可達(dá)到峰值，N.thermolilacinus LLJ-05則需要11天左右。S.fungicidicus LLJ-04和N.thermolilacinus LLJ-05產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)較為穩(wěn)定，抑制率隨時(shí)間變化無(wú)幾。通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)影響發(fā)酵條件的溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量進(jìn)行優(yōu)化：S.fungicidicus LLJ-04的

8、最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，裝液量為100ml；N.thermolilacinus LLJ-05的最優(yōu)發(fā)酵條件則為溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，裝液量為75ml。
　　S.fungicidicus LLJ-04和N.thermolilacinus LLJ-05所產(chǎn)抗真菌物質(zhì)在40℃以下具有熱穩(wěn)定性，但處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)；此物質(zhì)耐堿不耐酸，在近中性環(huán)境中最為穩(wěn)定。將此物質(zhì)在用不同pH值緩沖液處理過(guò)的濾紙上展層后

9、進(jìn)行生物顯影，發(fā)現(xiàn)不同pH下的移動(dòng)距離相近，表明該產(chǎn)物可能為中性抗生素；經(jīng) Doskochilova溶劑系統(tǒng)層析后，S.fungicidicus LLJ-04提取液在Ⅱ、Ⅴ兩個(gè)溶劑系統(tǒng)中的Rf值較大，N.thermolilacinus LLJ-05提取液在Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三個(gè)溶劑系統(tǒng)中具有較大的Rf值。進(jìn)行紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)，S.fungicidicus LLJ-04提取液在253nm、338nm處具有2個(gè)吸收峰，處于紫外吸收區(qū)；N.therm