中華絨螯蟹腦組織促性腺釋放激素類似物分離、免疫定位及功能鑒定.pdf

1、卵母細(xì)胞在完成卵黃積累后,減數(shù)分裂重啟,進(jìn)入最后的生理(減數(shù)分裂)成熟階段,只有達(dá)到最后的生理成熟,卵母細(xì)胞才能正常排卵、受精。卵母細(xì)胞最終成熟以生發(fā)泡破裂(germinal vesicle break down，GVBD)為標(biāo)志,在脊椎動(dòng)物,卵母細(xì)胞最終成熟受下丘腦分泌的促性腺釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)調(diào)控,GnRH通過(guò)刺激垂體釋放卵泡刺激素(follicle stimulati

2、ng hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH),誘發(fā)GVBD,導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟,但在蝦蟹類甲殼動(dòng)物是否存在類似調(diào)控通路尚不清楚。
　　本研究以我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)為研究對(duì)象,應(yīng)用反向高效液相色譜法(RP-HPLC)從中華絨螯蟹腦組織提取液分級(jí)分離了GnRH類似物,使用章魚(yú)促性腺釋放激素抗體(anti-octGnRH)對(duì)分離組分進(jìn)行免疫斑

3、點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)鑒定,獲得了高純度免疫反應(yīng)呈陽(yáng)性GnRH類似物分離組分,對(duì)該 GnRH類似物進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)分析,結(jié)果表明,蟹腦組織中GnRH類似物具有兩個(gè)亞型,均為十一肽,即QSYHFSHGWKP與QAYHFSHGWKP,分別命名為EsGnRH-Ⅰ和EsGnRH-Ⅱ,分子量為1356.6Da與1373.6D。與其他物種30種 GnRH類型進(jìn)行比對(duì)顯示中華絨螯蟹 GnRH類似物氨基

4、酸序列具有GnRH家族相同氨基酸保守位點(diǎn),其中 Q1、H4、S6、G8、P11五個(gè)氨基酸位點(diǎn)與脊椎動(dòng)物的GnRH-Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型完全相同,W9位點(diǎn)與脊椎動(dòng)物GnRH-Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型相完全一致。同時(shí)該類似物具有無(wú)脊椎動(dòng)物GnRH典型結(jié)構(gòu),即與脊椎動(dòng)物類似物相比在第一位氨基酸后同樣多插入了兩個(gè)氨基酸,并且具有無(wú)脊椎動(dòng)物相一致的F5位點(diǎn),特別是其中一種亞型與與海生蠕蟲(chóng) GnRH僅在第十位氨基酸有差異。隨后根據(jù)獲得多肽序列,制備兔抗中華絨螯

5、蟹GnRH類似物抗體(anti-EsGnRH),使用anti-EsGnRH進(jìn)行腦組織免疫組化分析,結(jié)果表明,在前腦的第8與11號(hào)細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)中型與小型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)免疫陽(yáng)性物質(zhì),并且在中腦第10號(hào)細(xì)胞群發(fā)現(xiàn)小型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有免疫陽(yáng)性物質(zhì),最后在嗅葉外周的小型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)免疫陽(yáng)性物質(zhì)。在后腦部位雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫陽(yáng)性細(xì)胞群,但是在連接后腦和胸神經(jīng)節(jié)的食道下神經(jīng)節(jié)以及第二觸角神經(jīng)纖維中發(fā)現(xiàn)免疫陽(yáng)性物質(zhì)分布在神經(jīng)束中,表明GnRH分

6、泌后可能通過(guò)這兩條神經(jīng)通道運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞部位,對(duì)卵母細(xì)胞最終成熟過(guò)程產(chǎn)生影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推斷,根據(jù)氨基酸序列人工合成中華絨螯蟹EsGnRH-Ⅰ、EsGnRH-Ⅱ,通過(guò)活體注射人工合成GnRH進(jìn)行誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,單獨(dú)注射時(shí)這兩種亞型均可促進(jìn)卵母細(xì)胞 GVBD發(fā)生,與空白對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.05),特別是EsGnRH-Ⅰ注射組在500ng/ml時(shí)效果最為明顯,GVBD比例為40％,與空白對(duì)照組相比具有極

7、顯著性差異(P<0.01)。兩種亞型同時(shí)注射與單獨(dú)注射效果相同,沒(méi)有表現(xiàn)出協(xié)同作用。在脊椎動(dòng)物中 GnRH末端均存在高度保守甘氨酸(Gly,G)位點(diǎn),為了驗(yàn)證該位點(diǎn)對(duì)EsGnRH活性的影響,人工合成添加G的突變體(EsGnRH1-12),與空白對(duì)照組相比GVBD比例并沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明肽段末端添加的G對(duì)EsGnRH活性并無(wú)影響。這些實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)中華絨螯蟹GnRH具有與脊椎動(dòng)物相似功能,同時(shí)表明在甲殼動(dòng)物中確實(shí)存在腦-性