多年生簇毛麥基因組新重復(fù)序列的分離及其在小麥抗病新種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、簇毛麥屬(Dasypyrum原作Haynaldia)包括二倍體一年生簇毛麥（D.villosum，染色體組為VV），二倍體多年生簇毛麥(D.breviaristatum，染色體組為VbVb)和四倍體多年生簇毛麥(D.breviaristatum，染色體組為VbVbVbVb)。一年生簇毛麥主要分布在地中海沿岸，而多年生簇毛麥主要分布在西北非的山區(qū)，希臘和摩洛哥。在植物分類上屬禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）的小麥亞

2、族（Triticinae），是小麥的野生近緣種，具有抗白粉病、抗葉銹病和稈銹、抗全蝕病、分蘗力強(qiáng)、小穗數(shù)多、耐旱耐寒、耐鹽和蛋白質(zhì)含量高等許多栽培小麥所需要的優(yōu)良性狀，是小麥高產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)育種的重要遺傳資源。
　　 迄今為止，對(duì)簇毛麥屬物種研究仍有如下不足：(1)四倍體多年生簇毛麥在該屬中的遺傳進(jìn)化關(guān)系一直存在爭(zhēng)議。特別是對(duì)四倍體多年生簇毛麥與二倍體多年生簇毛麥的染色體組關(guān)系研究上，缺乏分子和細(xì)胞學(xué)證據(jù)。(2)可在育種中利用的

3、簇毛麥染色體組（臂）特異分子標(biāo)記不能滿足小麥-簇毛麥新種質(zhì)鑒定的需求，需要進(jìn)一步挖掘和開發(fā)。(3)我們?cè)陂_展將四倍體多年生簇毛麥抗白粉和抗條銹基因?qū)胄←湹难芯抗ぷ髦?，育成了一批小?四倍體多年生簇毛麥抗病漸滲系，但是這些抗病漸滲系中外源染色質(zhì)的同源群關(guān)系尚未明確。(4)涉及二倍體一年生簇毛麥1V、4V和6V染色體的抗?。ɑ蚋弋a(chǎn)）易位系已經(jīng)育成，但是涉及2V、3V、5V和7V染色體的易位系還未見報(bào)道。
　　 本文著重解決上述4個(gè)

4、問題。本文對(duì)四倍體多年生簇毛麥在簇毛麥屬的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了深入研究；創(chuàng)制并用建立的多個(gè)EST-STS標(biāo)記和PLUG標(biāo)記鑒定了小麥-四倍體簇毛麥附加系；誘導(dǎo)和鑒定了小麥-二倍體一年生簇毛麥2V、3V、5V和7V補(bǔ)償性羅伯遜易位系。研究結(jié)果如下：
　　 1．簇毛麥屬物種的遺傳進(jìn)化關(guān)系：(1)利用RAPD技術(shù)對(duì)二倍體一年生簇毛麥、四倍體多年生簇毛麥和小麥族黑麥、中間偃麥草、擬鵝觀草和黑麥等物種進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明二倍體一年生簇毛

5、麥和四倍體多年生簇毛麥不能聚在一起，表明四倍體多年生簇毛麥不是由二倍體一年生簇毛麥加倍而來。(2)吉姆薩C分帶結(jié)果顯示，四倍體多年生簇毛麥與二倍體多年生簇毛麥具有較多的中間帶，這些帶紋多屬弱帶型，并且二者的帶型還有所差異；而二倍體一年生簇毛麥具有較多的端帶，這些帶紋多屬強(qiáng)帶型。因此，C分帶的證據(jù)只能粗略證明四倍體多年生簇毛麥與二倍體多年生簇毛麥遺傳關(guān)系較近，而與二倍體一年生簇毛麥相對(duì)較遠(yuǎn)。(3)克隆了簇毛麥屬三物種的葉綠體infA基因和

6、線粒體trnfM及rrn18基因，并以此對(duì)這些基因序列分別進(jìn)行了bootstrap分析。分析結(jié)果支持四倍體多年生簇毛麥?zhǔn)怯啥扼w多年生簇毛麥加倍而來的觀點(diǎn)。(4)基因組原位雜交和利用核糖體基因pTa71為探針的原位雜交清楚的表明四倍體多年生簇毛麥?zhǔn)怯啥扼w多年生簇毛麥加倍產(chǎn)生的。(5)以黑麥基因組重復(fù)序列pSc74為探針的原位雜交表明，從二倍體多年生簇毛麥加倍到四倍體多年生簇毛麥的過程中，不僅發(fā)生了染色體的重排，還發(fā)生了基因組DNA水平

7、上的重組現(xiàn)象。
　　 2．簇毛麥基因組或單染色體分子標(biāo)記：(1)分離得到簇毛麥基因組1個(gè)新的重復(fù)序列pDb12H（或稱為OPH12），該重復(fù)序列和大麥基因組Sabrina反轉(zhuǎn)錄重復(fù)序列具有95％的同源性。根據(jù)pDb12H設(shè)計(jì)引物，對(duì)含簇毛麥染色質(zhì)的材料和大量對(duì)照材料進(jìn)行擴(kuò)增，建立了簇毛麥基因組SCAR標(biāo)記，該標(biāo)記被用來篩選小麥-四倍體多年生簇毛麥抗病漸滲系和小麥-二倍體一年生簇毛麥易位系。以pDb12H為探針對(duì)小麥族大量物種進(jìn)行

8、原位雜交，結(jié)果表明，pDb12H僅分布在小麥族二倍體一年生簇毛麥V基因組、多年生簇毛麥Vb基因組、大麥H基因組和中間偃麥草Js基因組上，即pDb12H高拷貝存在于V基因組，Vb基因組，H基因組和Js基因組上，而寡拷貝存在于小麥族其他基因組上，Southern blot也證實(shí)了上述結(jié)果。根據(jù)FISH和Southern blot結(jié)果推測(cè)pDb12H在小麥族各基因組(V、Vb、H和JS基因組除外)分化前期可能就失去了轉(zhuǎn)座活性。Kishii等曾

9、用原位雜交和分子標(biāo)記手段證實(shí)百薩偃麥草J基因組和黑麥R基因組參與了中間偃麥草Js基因組的形成，認(rèn)為中間偃麥草基因組應(yīng)為StJs(V-J-R)s。本文發(fā)現(xiàn)大麥H基因組也參與了中間偃麥草基因組進(jìn)化，因此我們建議將中間偃麥草基因組暫時(shí)補(bǔ)充修訂為StJs(V-J-R-H)s。(2)利用小麥第1到第7同源群的943對(duì)EST-STS引物對(duì)四倍體多年生簇毛麥和中國春進(jìn)行篩選，PCR產(chǎn)物利用HaeIII、MspI、RsaI和Alul四種酶進(jìn)行酶切，獲得

10、了474個(gè)STS標(biāo)記。同時(shí)還篩選了小麥第1到第7同源群的56對(duì)PLUG引物，利用TaqI和HaeIII兩種酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，篩選到6個(gè)PLUG標(biāo)記。
　　 3．小麥-四倍體多年生簇毛麥附加系的鑒定：利用建立的SCAR分子標(biāo)記對(duì)小麥-四倍體多年生簇毛麥抗病漸滲系進(jìn)行初步篩選，然后利用C分帶對(duì)篩選出的漸滲系進(jìn)行普查，結(jié)果顯示這批抗病漸滲系中只有2種不同類型的附加系Y93-1-6-1和Y93-1-A6-4。利用上述篩選到的STS

11、標(biāo)記和PLUG標(biāo)記對(duì)Y93-1-6-1和Y93-1-A6-4進(jìn)行鑒定。首次發(fā)現(xiàn)Y93-1-6-1和Y93-1-A6-4中四倍體簇毛麥染色體均發(fā)生了重組。附加系Y93-1-6-1中四倍體簇毛麥染色體長臂為6VbL，其短臂發(fā)生了6VbS和7VbS染色體片段的重組；而附加系Y93-1-A6-4中四倍體簇毛麥染色體發(fā)生了更為復(fù)雜的染色體重組，其短臂為6VbS和7VbS的重組，長臂為1VbL、2vbL和7VbL的重組。
　　 4．小麥-二

12、倍體一年生簇毛麥易位系的創(chuàng)制與鑒定：利用中國春-二倍體一年生簇毛麥附加系與相應(yīng)的中國春?jiǎn)误w進(jìn)行雜交獲得雙單體，然后雙單體進(jìn)行自交，對(duì)所獲得的自交種子進(jìn)行篩選獲得相關(guān)易位系。(1)篩選來自雙單體40+2V+2D的自交后代660個(gè)單株，獲得4個(gè)雜合T2VL.2DS易位系，3個(gè)雜合T2VS.2DL易位系。(2)篩選來自雙單體40+3V+3D的自交后代496個(gè)單株，獲得5個(gè)T3DS.3VL易位系，3個(gè)雜合T3DL.3VS易位系。(3)篩選來自雙

13、單體40+5V+5D的自交后代342個(gè)單株，獲得12個(gè)雜合的T5DL.5VS易位系，未發(fā)現(xiàn)T5DS.5VL易位系。(4)篩選來自雙單體40+7V+7D的自交后代384個(gè)單株，獲得6個(gè)雜合T7DS.7VL易位系，2個(gè)雜合T7DL.7VS易位系。對(duì)上述雜合易位系的自交種子進(jìn)行篩選，目前都已獲得了純合的易位系，這些優(yōu)異的種質(zhì)資源可用于小麥育種。
　　 綜上，本論文對(duì)簇毛麥屬種間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)簇毛麥特異分子標(biāo)記進(jìn)行了進(jìn)一步