豬早期胚胎細(xì)胞核移植程序優(yōu)化研究.pdf

1、早期胚胎卵裂球細(xì)胞具有發(fā)育全能性，每個胚胎卵裂球細(xì)胞在適宜的條件下都能單獨(dú)發(fā)育為一個完整的個體。一個早期胚胎細(xì)胞可以分離多個卵裂球，以此作為核供體進(jìn)行胚胎細(xì)胞核移植，可以大量擴(kuò)繁優(yōu)良品種的數(shù)量，增加瀕危動物的數(shù)量，為科學(xué)研究提供大量遺傳同質(zhì)的動物，提高轉(zhuǎn)基因和性別控制技術(shù)的效率，提供基因型相同的器官或組織供人類移植。 然而胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)總的效率比較低，一個重要因素就是核移植技術(shù)的環(huán)節(jié)比較多，程序比較復(fù)雜。隨著IVM-IVF-

2、IVC胚胎工程技術(shù)和顯微操作技術(shù)的不斷發(fā)展，胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)程序?qū)⒅饾u得到簡化和優(yōu)化，為了探索適合實驗室批量生產(chǎn)胚胎的細(xì)胞核移植操作條件，優(yōu)化胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)的程序進(jìn)行了本實驗。 本實驗以豬為實驗動物，對豬胚胎細(xì)胞核移植供體(早期胚胎細(xì)胞)的來源、卵裂球細(xì)胞分離方法、核移植重建胚的電激活最佳參數(shù)、核移植受體(去核卵母細(xì)胞)的激活時序以及核移植重建胚體外培養(yǎng)系統(tǒng)相關(guān)問題進(jìn)行了研究，旨在探索一種適用于豬胚胎細(xì)胞核移植的科學(xué)方法，

3、提高豬胚胎細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育率，優(yōu)化胚胎細(xì)胞核移植程序。根據(jù)對實驗數(shù)據(jù)的分析，研究結(jié)果如下： 試驗1：早期胚胎細(xì)胞獲得程序的優(yōu)化。本實驗以體外培養(yǎng)44～48h后成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF。通過比較不同類型精液(鮮精、附睪精液和冷凍—解凍精液)IVF的卵裂率、4～8-細(xì)胞胚胎率以及8-細(xì)胞以上胚胎率差異，篩選出適合本實驗室獲得早期胚胎細(xì)胞來源的精液。結(jié)果表明：IVF時，鮮精、附睪精液和冷凍—解凍精液組的卵裂率分別為40.83﹪

4、(49/120)、39.47﹪(45/114)、34.68﹪(43/124)，差異顯著(P＜0.05)；4～8-細(xì)胞胚胎率分別為16.67﹪(20/120)、15.79﹪(18/114)、15.32﹪(19/124)，差異不顯著(P＞0.05)；8-細(xì)胞以上胚胎率分別為2.50﹪(3/120)、1.75﹪(2/114)、0.81﹪(1/124)，差異不顯著(P＞0.05)；電激活孤雌對照組在卵裂率52.22﹪(47/90)、4～8-細(xì)胞

5、胚胎率28.89﹪(26/90)和8-細(xì)胞以上胚胎率6.67﹪(6/90)上，與IVF組均差異極顯著(P＜0.01)。實驗結(jié)果說明，用冷凍—解凍精液IVF時，與用鮮精和附睪精液IVF的效果相當(dāng)，可以不用超排體內(nèi)胚胎，節(jié)約采集鮮精和附睪精液的時間和經(jīng)費(fèi)，優(yōu)化胚胎細(xì)胞核移植的供核體來源。 試驗2：胚胎卵裂球細(xì)胞分離方法的優(yōu)化。本實驗以酶消化法(0.25﹪鏈霉蛋白酶液、0.5﹪胰蛋白酶液和0.5﹪鏈霉蛋白酶液)和酸化法(酸性臺氏液(p

6、H2.5))分離IVF早期胚胎卵裂球細(xì)胞，通過比較酶消化法和酸化法在胚胎卵裂球細(xì)胞分離時間和獲得率上的差異，找出分離胚胎卵裂球細(xì)胞的適宜方法。結(jié)果表明：酸性臺氏液組、0.25﹪鏈霉蛋白酶液組、0.5﹪胰蛋白酶液組和0.5﹪鏈霉蛋白酶液組的胚胎卵裂球細(xì)胞分離率，分別為15.33秒/個(230/120)、205.00秒/個(2870/112)、116.67秒/個(1750/120)、150.00秒/個(2100/112)，各組差異極顯著(P

7、＜0.01)；胚胎卵裂球細(xì)胞的獲得率分別為50.83﹪(61/120)、87.50﹪(98/112)、68.33﹪(82/120)、80.36﹪(90/112)，0.25﹪鏈霉蛋白酶液組與0.5﹪鏈霉蛋白酶液組差異不顯著(P＞0.05)，0.25﹪鏈霉蛋白酶液組與酸性臺氏液組、0.5﹪胰蛋白酶液組差異極顯著(P＜0.01)。實驗結(jié)果說明，0.25﹪鏈霉蛋白酶和0.5﹪鏈霉蛋白酶液在分離胚胎卵裂球細(xì)胞的效果上相當(dāng)，但0.25﹪鏈霉蛋白酶液

8、獲得的卵裂球細(xì)胞率最高，故在實驗中采用0.25﹪鏈霉蛋白酶液分離豬胚胎細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。 試驗3：豬胚胎細(xì)胞核移植重建胚電激活參數(shù)的優(yōu)化。分離的胚胎卵裂球細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞以實驗設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行電激活，通過比較核移植重建胚的卵裂率、4～8-細(xì)胞胚胎率和8-細(xì)胞以上胚胎率的差異篩選出適合實驗室豬胚胎細(xì)胞核移植最佳電激活參數(shù)。結(jié)果表明： (1)不同電場強(qiáng)度：在固定脈沖寬度40μs和一次脈沖條件下，以電場強(qiáng)度1.0KV·cm

9、-1、1.3KV·cm-1、1.5KV·cm-1、2.0KV·cm-1分別對核移植重建胚進(jìn)行電激活，重建胚的卵裂率分別為33.05﹪(39/118)、50.78﹪(65/128)、41.09﹪(53/129)、38.66﹪(46/119)，電場強(qiáng)度為1.3KV·cm-1時，卵裂率最高，與其它試驗組差異極顯著(P＜0.01)；4～8-細(xì)胞胚胎率分別為10.17﹪(12/118)、20.31﹪(26/128)、15.50﹪(20/129)、

10、13.45﹪(16/119)，電場強(qiáng)度為1.3KV·cm-1時，4～8-細(xì)胞胚胎率最高，與其它試驗組差異極顯著(P＜0.01)；8-細(xì)胞以上胚胎率分別為0.85﹪(1/118)、4.69﹪(6/128)、2.33﹪(3/129)、1.68﹪(2/119)，電場強(qiáng)度為1.3KV·cm-1時，核移植重建胚的8-細(xì)胞以上胚胎率最高，與其它試驗組差異顯著(P＜0.05)。實驗結(jié)果說明，在固定脈沖寬度40μs和一次脈沖條件下，電場強(qiáng)度為1.3KV

11、·cm-1時，核移植重建胚的卵裂率、4～8-細(xì)胞胚胎率和8-細(xì)胞以上胚胎率最高。 (2)不同脈沖寬度：在固定電場強(qiáng)度1.3KV·cm-1和一次脈沖條件下，以脈沖寬度20μs、40μs、60μs、80μs分別對核移植重建胚進(jìn)行電激活，核移植重建胚的卵裂率分別為32.00﹪(40/125)、52.71﹪(68/129)、49.19﹪(61/124)、43.44﹪(53/122)，脈沖寬度40μs組的卵裂率最高，與脈沖寬度60μs組差

12、異顯著(P＜0.05)，與脈沖寬度20μs組和脈沖寬度80μs組差異極顯著(P＜0.01)；4～8-細(xì)胞胚胎率分別為8.80﹪(11/125)、16.28﹪(21/219)、14.52﹪(18/124)、9.84﹪(12/122)，脈沖寬度40μs組的4～8-細(xì)胞胚胎率最高，與脈沖寬度60μs組差異不顯著(P＞0.05)；8-細(xì)胞以上胚胎率分別為0.80﹪(1/215)、3.88﹪(5/129)、3.23﹪(4/124)、1.64﹪(2

13、/122)，脈沖寬度40μs組與脈沖寬度60μs組差異不顯著(P＞0.05)，與脈沖寬度20μs和脈沖寬度80μs組差異顯著(P＜0.05)。實驗結(jié)果說明，以1.3KV·cm-1電場強(qiáng)度和一次脈沖的條件對豬核移植重建胚進(jìn)行電激活，脈沖寬度40μs可以獲得較好的卵裂率和核移植重建胚發(fā)育率。 實驗結(jié)果表明，在本實驗室以1.3KV·cm-1電場強(qiáng)度、40μs脈沖寬度和一次脈沖可以獲得較高的核移植重建胚的卵裂率、4～8-細(xì)胞胚胎率和8-

14、細(xì)胞以上胚胎率，故在實驗中采用該參數(shù)對核移植重建胚進(jìn)行電激活。 試驗4：去核卵母細(xì)胞激活時序的優(yōu)化。通過比較融合前激活去核受體胞質(zhì)和融合前不激活去核受體胞質(zhì)在融合率、核移植胚胎卵裂率、4～8-細(xì)胞胚胎率和8-細(xì)胞以上胚胎率的差異，找到適合實驗室的去核卵母細(xì)胞激活時序，優(yōu)化豬胚胎細(xì)胞核移植的程序。結(jié)果表明：激活組和不激活組的融合率分別為67.21﹪(82/122)、64.46﹪(78/121)，差異不顯著(P＞0.05)；卵裂率分

15、別為37.70﹪(46/122)、20.66﹪(25/121)，差異極顯著(P＜0.01)；4～8-細(xì)胞胚胎率分別為17.21﹪(21/122)、3.31﹪(4/121)，差異極顯著(P＜0.01)；8-細(xì)胞以上胚胎率分別為4.10﹪(5/122)、0.83﹪(1/121)，差異極顯著(P＜0.01)。實驗結(jié)果說明，激活組的效果好于對照組，融合前激活去核卵母細(xì)胞組的核移植胚胎的體外發(fā)育率較高，優(yōu)化豬胚胎細(xì)胞核移植程序。 試驗5：

16、豬胚胎細(xì)胞核移植重建胚體外培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)化。激活后的核移植重建胚均進(jìn)行早期體外培養(yǎng)，核移植重建胚放入含顆粒細(xì)胞單層的胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行共培養(yǎng)或放入胚胎培養(yǎng)微滴中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，旨在探索實驗室胚胎細(xì)胞核移植重建胚體外培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)時，核移植重建胚的卵裂率分別為29.73﹪(33/111)、30.10﹪(31/103)，差異不顯著(P＞0.05)；4～8-細(xì)胞胚胎率分別為9.01﹪(10/111)、6.80﹪(7

17、/103)，差異顯著(P＜0.05)；8-細(xì)胞以上胚胎率分別為2.70﹪(3/111)、1.94﹪(2/103)，差異不顯著(P＞0.05)。實驗結(jié)果說明，顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)體系能增加4～8-細(xì)胞胚胎的數(shù)量，克服豬胚胎4-細(xì)胞阻滯，有利于核移植重建胚的體外培養(yǎng)。 綜上所述：在本實驗室進(jìn)行豬胚胎細(xì)胞核移植時，優(yōu)化的程序為：選用豬冷凍—解凍的精液與成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF獲得早期胚胎細(xì)胞，用0.25﹪的鏈霉蛋白酶分離胚胎卵裂球細(xì)胞，分