mRFP1-獼猴-豬異種體細胞核移植胚胎核重編程的研究.pdf

1、獼猴異種間體細胞核移植(iSCNT)能夠在避免倫理道德的實驗限制下，得到與人類具有相似遺傳背景的克隆胚胎，為今后利用囊胚互補技術獲得靈長類動物器官、建立治療性克隆非人靈長類動物模型等研究提供研究基礎。然而，目前僅有數(shù)例有關獼猴iSCNT胚胎的研究，且克隆胚胎的重編程及發(fā)育能力均十分低下。研究表明iSCNT胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳修飾及重要基因表達的異常是供體核重編程不完全的主要原因。為了改善iSCNT胚胎的發(fā)育能力，深入研究組蛋白乙?；?/p>

2、飾及重要基因表達對異種間核移植胚胎重編程的影響，本研究以表達紅色熒光的獼猴皮膚成纖維細胞為供體細胞，以去核的豬卵母細胞為受體細胞構建異種重構胚，并與表達紅色熒光的豬同種間體細胞核移植(SCNT)胚胎比較了體外發(fā)育能力的差異。此外，使用不同類型的小分子化合物對異種重構胚進行處理，探討了藥物處理對獼猴-豬iSCNT重構胚重編程及發(fā)育能力的影響。研究結果如下:
　　一、轉單體紅色熒光蛋白(mRFP1)獼猴-豬iSCNT與豬-豬SCNT胚

3、胎發(fā)育能力的比較
　　實驗一:本實驗建立了獼猴成纖維細胞系，使用NucleofectorTM電轉染儀進行mRFP1電穿孔轉染，程序為U-023時轉染效率最高，轉染效率約75.63％。G418篩選濃度為200μg/mL，在篩選到10天時，可以獲得能穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的獼猴成纖維細胞。經(jīng)核型分析顯示，傳至第四代的mRFP1獼猴成纖維細胞中，77.36％為二倍體并具有42條形態(tài)正常的染色體。
　　實驗二:mRFP1-獼猴-豬iS

4、CNT重構胚的卵裂率為71.53％，mRFP1-豬-豬SCNT重構胚的卵裂率為80.30％，兩者在卵裂率上并無顯著性差異。然而，mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎的囊胚率為2.04％，顯著低于mRFP1-豬-豬SCNT胚胎的囊胚率(10.19％，P＜0.05)。大部分mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎發(fā)育阻滯在8-16階段，而不能達到囊胚階段。
　　二、去乙?；敢种苿?HDACi)對mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎發(fā)育能力的影

5、響
　　實驗一:2 mM valproic acid(VPA)處理豬-豬SCNT克隆胚胎24 h后，囊胚率顯著高于對照組，分別為20.04％和10.66％(P＜0.05)，表明VPA能夠顯著提高豬-豬SCNT克隆胚胎發(fā)育能力。在mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎中，0、2、4、8 mM VPA處理iSCNT胚胎的卵裂率分別為72.34％，70.69％，68.24％，70.48％，囊胚率分別為1.24％，1.29％，1.17％，0.

6、83％，均無顯著性差異。2 mM VPA分別對mRFP1-獼猴-豬iSCNT重構胚培養(yǎng)0、12、24、48 h，結果顯示囊胚率分別為1.10％，1.28％，1.36％和0.86％，并沒有顯著性差異。
　　實驗二:使用1μM CUDC-101處理豬-豬SCNT克隆胚胎24 h后，囊胚率顯著高于對照組，分別為24.61％和11.58％(P＜0.05)，表明CUDC-101能夠顯著提高豬-豬SCNT克隆胚胎發(fā)育能力。在mRFP1-獼猴-

7、豬iSCNT胚胎中，0、0.1、1、10μM CUDC-101處理iSCNT胚胎卵裂率(61.31％，62.37％，65.00％，57.90％)、囊胚率(1.22％，1.06％，1.34％，0.95％)均無顯著性差異。1μM CUDC-101分別對mRFP1-獼猴-豬iSCNT重構胚培養(yǎng)0、12、24、48 h，結果顯示與對照組相比，各處理組的卵裂率(68.23％，64.92％，67.91％，62.14％)和囊胚率(1.53％，1.42

8、％，2.06％，1.32％)均無顯著性差異。
　　實驗三:采用2 mM的VPA、1μM CUDC-101對iSCNT激活后胚胎處理6h。通過acH3K9免疫染色可以看出，VPA、CUDC-101處理胚胎的acH3K9水平與對照組無顯著差異。
　　三、小分子化合物RepSox對mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎重編程的影響
　　實驗一:在豬-豬SCNT胚胎中在添加濃度為0、5、25、50μM的RepSox處理24 h后，

9、結果顯示，各組間囊胚發(fā)育率并無顯著性差異(10.47％，14.53％，15.39％，7.12％)，因此，使用囊胚率最高的25μM處理組作為接下來實驗的處理濃度;25μM RepSox處理0、1、2、4、7d后，囊胚發(fā)育率相均無顯著性差異(10.28％,14.22％,12.05％,12.81％,7.06％)。
　　實驗二:使用5、25、和50μM的RepSox分別對mRFP1-獼猴-豬克隆胚胎處理1d，表達紅色熒光的胚胎被判定為是m

10、RFP1-獼猴-豬克隆胚胎。結果顯示，5、25、50μM RepSox處理組(1.66％，2.07％，0.62％)與對照組(1.09％)之間沒有顯著差異。利用25μM的RepSox處理異種重構胚1、2、4、7d，結果表明處理1、2、4、7d的異種重構胚的囊胚率與對照組相比，未達到顯著性差異(2.39％和1.95％,1.13％,0％,1.23％)。
　　實驗三:為了檢測RepSox處理對mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎Oct4的作

11、用，Oct4免疫染色可以看出RepSox處理iSCNT囊胚期的Oct4水平顯著高于未處理的iSCNT囊胚（P＜0.05）。
　　實驗四:25μM RepSox處理mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎1d后，檢測2-4細胞期iSCNT胚胎的mRNA相對表達量，結果表明Oct4和Nanog的mRNA水平均顯著高于未處理組(P＜0.05)，而Sox2的表達量無顯著性差異。RepSox處理的iSCNT胚胎的Bax和Bcl2水平均有不同程度的

12、升高，但是Bax/Bcl2的比率沒有顯著性差異。
　　以表達單體紅色熒光蛋白的獼猴成纖維細胞進行獼猴-豬異種核移植胚胎，簡單、直觀、有效的判定了異種重構胚核的來源。兩種去乙?；种苿]有對獼猴-豬異種移植胚胎的表觀遺傳及發(fā)育能力產(chǎn)生影響。但是另一種小分子化合物RepSox提高了獼猴-豬異種克隆配重多能性相關基因Oct4和Nanong的表達量，間接的提高了胚胎的發(fā)育能力。雖然沒有提高異種克隆胚胎發(fā)育到囊胚的能力，但是為提高異種核移植