家豬干擾素ω及δ基因家族的特征及抗藍(lán)耳病應(yīng)用研究.pdf

1、I型干擾素是一種廣泛應(yīng)用于抗病毒,抗腫瘤和免疫調(diào)控方面的細(xì)胞因子。首先,我們從干擾素的進(jìn)化入手,討論了I型干擾素在魚類、鳥類和哺乳動(dòng)物中的不同形式。并具體的分析了哺乳動(dòng)物中I型干擾素各亞型的進(jìn)化及功能。隨后,我們具體分析了從病毒誘導(dǎo)干擾素表達(dá)到干擾素發(fā)揮抗病毒作用流程中的各個(gè)步驟:病毒誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生,干擾素與受體結(jié)合激活下游信號(hào),干擾素激活的信號(hào)通路活化干擾素相關(guān)基因的表達(dá),干擾素相關(guān)基因發(fā)揮抗病毒作用等。我們總結(jié)了參于此信號(hào)通路的具

2、體蛋白分子,并由此進(jìn)一步分析了病毒通過對(duì)這些步驟中的具體環(huán)節(jié)的作用,從而達(dá)到免疫逃逸目的的過程。
　　豬繁殖與呼吸綜合癥俗稱豬藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PPRSV)引起的一種傳染性疾病。藍(lán)耳病以妊娠母豬的繁殖障礙(流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病為特征,其危害已幾乎遍極世界所有養(yǎng)豬國(guó)家。本文簡(jiǎn)述

3、了豬繁殖與呼吸綜合癥的流行與危害,PRRSV病毒分類,蛋白結(jié)構(gòu)功能,作用方式及特點(diǎn)等。由于PRRSV病毒作用過程中有強(qiáng)烈的免疫抑制作用,PRRSV的抗病毒藥物和疫苗的研究一直是一個(gè)難題。我們從免疫和疫苗的角度分析了PRRSV病毒的免疫特點(diǎn),PRRSV疫苗及存在的問題,PRRSV疫苗佐劑研究的進(jìn)展等。最后,我們簡(jiǎn)要敘述了2006-2007在我國(guó)等亞洲國(guó)家大爆發(fā)的高致病性豬藍(lán)耳病及其特點(diǎn)。
　　干擾素ω屬于I型干擾素基因家族。利用BL

4、AST的方法,在已有的家豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索,發(fā)現(xiàn)了8條家豬干擾素∞功能基因和4條假基因。它們均在家豬1號(hào)染色體上。我們利用生物信息學(xué)工具分析了它們的基因序列性質(zhì)及在基因組中的位置。通過序列比對(duì),設(shè)計(jì)特異性引物從豬的PKl5細(xì)胞系基因組中調(diào)取干擾素ω各亞型的基因,將其克隆入表達(dá)載體pcDNA3.1,轉(zhuǎn)染BHK.21細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)并檢測(cè)了所表達(dá)各亞型干擾素ω在豬PK15細(xì)胞系上的抗病毒等活性。干擾素ω各亞型均具有抗病毒活性,其活性范圍大約在

5、10(4)-10(5)左右?？共《净钚宰罡叩母蓴_素ω7,其活性大約為活性最低的干擾素ω4的20倍。在用偽狂犬病毒(PRV,pseudorabies virus)和標(biāo)準(zhǔn)干擾素刺激物poly(I).poly(C)的刺激后,分別檢測(cè)了豬PK15細(xì)胞株和外周血單核細(xì)胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cells)中干擾素ω各亞型的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在病毒和poly(I).poly(C)的刺激后,干擾素ω2/

6、ω6得到了最大量的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　我們從家豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了11條IFN-6基因和7條假基因,對(duì)他們進(jìn)行了基因組定位和序列,進(jìn)化分析。并依據(jù)進(jìn)化和序列比對(duì),相似性分析結(jié)果,克隆表達(dá)了其中3個(gè)有代表性的基因并對(duì)它們的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。對(duì)偽狂犬病毒(PRV)抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:IFN-δ均具有I型干擾素特征性的抗病毒功能,但抗病毒活性的差距很大。通過對(duì)IFN-δ抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)分析,我們發(fā)現(xiàn):IFN-δ可以與I型干擾

7、素受體IFNAR結(jié)合,并通過JAK/STAT通路活化信號(hào)通路分子STAT,從而誘導(dǎo)抗病毒基因(ISG)的表達(dá),發(fā)揮抗病毒作用。并可以通過誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子表達(dá)達(dá)到調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。但各亞型之間存在較大的差異。
　　家豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)是在世界范圍內(nèi)對(duì)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)影響很大的一種家豬傳染病病毒。由于此病毒的特殊性質(zhì),市場(chǎng)上一直缺乏安全有效的疫苗。在本項(xiàng)研究中,我們將家豬IFN-δ8在細(xì)胞和動(dòng)物體上用于抵抗PRRSV攻擊

8、,以及在動(dòng)物體上做為藍(lán)耳病滅活疫苗佐劑抵抗PRRSV攻擊。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,PoIFN-δ8直接注射家豬同時(shí)以PRRSV病毒攻擊,保護(hù)率可達(dá)80％。佐劑與藍(lán)耳病滅活疫苗(killed virus’vaccine,KV)聯(lián)用,一次免疫注射家豬后28天攻毒,保護(hù)率可達(dá)80％。PoIFN-δ8可以活化細(xì)胞免疫和體液免疫,促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)病毒的清除,防止或減輕動(dòng)物的病理癥狀,并可以較大的提高動(dòng)物在PRRSV病毒攻擊后的存活率。本項(xiàng)研究是迄今為止對(duì)PoI

9、FN-δ在動(dòng)物體上抗病毒和疫苗佐劑作用的首次探討。本項(xiàng)研究為未來應(yīng)對(duì)各種家豬病毒性疾病提供了一個(gè)新的可行方向。
　　到目前為止,證明非脊椎動(dòng)物中存在脊椎動(dòng)物螺旋細(xì)胞因子類似物的證據(jù)主要來源于生理生化水平的功能分析,然而缺乏遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的相關(guān)數(shù)據(jù)。以前的研究表明,利用比較基因組學(xué)的分析方法在果蠅的基因組內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)任何的細(xì)胞因子的同源序列。在本項(xiàng)研究中,我們從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到12種魚細(xì)胞因子的序列信息,利用Hid

10、den Markov Models構(gòu)建出每種細(xì)胞因子的一致性序列:我們進(jìn)一步利用SMART軟件計(jì)算得到每條一致性序列的保守區(qū)域,將這12條保守區(qū)域序列作為模板在果蠅RefSeq蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PSI-BLAST、比對(duì)分析,最后利用脊椎動(dòng)物螺旋細(xì)胞因子的性質(zhì)對(duì)候選序列進(jìn)行過濾篩選。通過分析,我們?cè)贒rosophila melanogaster中得到了一個(gè)蛋白序列,CGl4629(NP-569881),它與魚M17在氨基酸序列N端的101個(gè)

11、殘基存在25％一致性和46％相似性。進(jìn)一步分析表明,CGl4629屬于DUFl397蛋白質(zhì)家族,存在DUFl397特異性的保守序列,該家族的蛋白均為血淋巴細(xì)胞分泌的糖基化蛋白,并能夠在昆蟲脂肪體(fat body)中合成。根據(jù)以上分析,并考慮到M17與LIF/CNTF的同源性并且Dome受體與LIFR/CNTFR的同源性,我們認(rèn)為CGl4629是非脊椎動(dòng)物中LIF/CNTF/M17螺旋細(xì)胞因子的類似物,它為尋找非脊椎動(dòng)物中螺旋細(xì)胞因子的