家豬干擾素ω及δ基因家族的特征及抗藍耳病應(yīng)用研究.pdf

1、I型干擾素是一種廣泛應(yīng)用于抗病毒,抗腫瘤和免疫調(diào)控方面的細胞因子。首先,我們從干擾素的進化入手,討論了I型干擾素在魚類、鳥類和哺乳動物中的不同形式。并具體的分析了哺乳動物中I型干擾素各亞型的進化及功能。隨后,我們具體分析了從病毒誘導(dǎo)干擾素表達到干擾素發(fā)揮抗病毒作用流程中的各個步驟:病毒誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生,干擾素與受體結(jié)合激活下游信號,干擾素激活的信號通路活化干擾素相關(guān)基因的表達,干擾素相關(guān)基因發(fā)揮抗病毒作用等。我們總結(jié)了參于此信號通路的具

2、體蛋白分子,并由此進一步分析了病毒通過對這些步驟中的具體環(huán)節(jié)的作用,從而達到免疫逃逸目的的過程。
　　豬繁殖與呼吸綜合癥俗稱豬藍耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PPRSV)引起的一種傳染性疾病。藍耳病以妊娠母豬的繁殖障礙(流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病為特征,其危害已幾乎遍極世界所有養(yǎng)豬國家。本文簡述

3、了豬繁殖與呼吸綜合癥的流行與危害,PRRSV病毒分類,蛋白結(jié)構(gòu)功能,作用方式及特點等。由于PRRSV病毒作用過程中有強烈的免疫抑制作用,PRRSV的抗病毒藥物和疫苗的研究一直是一個難題。我們從免疫和疫苗的角度分析了PRRSV病毒的免疫特點,PRRSV疫苗及存在的問題,PRRSV疫苗佐劑研究的進展等。最后,我們簡要敘述了2006-2007在我國等亞洲國家大爆發(fā)的高致病性豬藍耳病及其特點。
　　干擾素ω屬于I型干擾素基因家族。利用BL

4、AST的方法,在已有的家豬基因組數(shù)據(jù)庫中搜索,發(fā)現(xiàn)了8條家豬干擾素∞功能基因和4條假基因。它們均在家豬1號染色體上。我們利用生物信息學(xué)工具分析了它們的基因序列性質(zhì)及在基因組中的位置。通過序列比對,設(shè)計特異性引物從豬的PKl5細胞系基因組中調(diào)取干擾素ω各亞型的基因,將其克隆入表達載體pcDNA3.1,轉(zhuǎn)染BHK.21細胞進行表達并檢測了所表達各亞型干擾素ω在豬PK15細胞系上的抗病毒等活性。干擾素ω各亞型均具有抗病毒活性,其活性范圍大約在

5、10(4)-10(5)左右?？共《净钚宰罡叩母蓴_素ω7,其活性大約為活性最低的干擾素ω4的20倍。在用偽狂犬病毒(PRV,pseudorabies virus)和標準干擾素刺激物poly(I).poly(C)的刺激后,分別檢測了豬PK15細胞株和外周血單核細胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cells)中干擾素ω各亞型的表達情況。結(jié)果顯示,在病毒和poly(I).poly(C)的刺激后,干擾素ω2/

6、ω6得到了最大量的誘導(dǎo)表達。
　　我們從家豬基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了11條IFN-6基因和7條假基因,對他們進行了基因組定位和序列,進化分析。并依據(jù)進化和序列比對,相似性分析結(jié)果,克隆表達了其中3個有代表性的基因并對它們的生物學(xué)功能進行了分析。對偽狂犬病毒(PRV)抗病毒實驗結(jié)果顯示:IFN-δ均具有I型干擾素特征性的抗病毒功能,但抗病毒活性的差距很大。通過對IFN-δ抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的實驗分析,我們發(fā)現(xiàn):IFN-δ可以與I型干擾

7、素受體IFNAR結(jié)合,并通過JAK/STAT通路活化信號通路分子STAT,從而誘導(dǎo)抗病毒基因(ISG)的表達,發(fā)揮抗病毒作用。并可以通過誘導(dǎo)其它細胞因子表達達到調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。但各亞型之間存在較大的差異。
　　家豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)是在世界范圍內(nèi)對畜牧業(yè)經(jīng)濟影響很大的一種家豬傳染病病毒。由于此病毒的特殊性質(zhì),市場上一直缺乏安全有效的疫苗。在本項研究中,我們將家豬IFN-δ8在細胞和動物體上用于抵抗PRRSV攻擊

8、,以及在動物體上做為藍耳病滅活疫苗佐劑抵抗PRRSV攻擊。動物實驗證明,PoIFN-δ8直接注射家豬同時以PRRSV病毒攻擊,保護率可達80％。佐劑與藍耳病滅活疫苗(killed virus’vaccine,KV)聯(lián)用,一次免疫注射家豬后28天攻毒,保護率可達80％。PoIFN-δ8可以活化細胞免疫和體液免疫,促進動物體內(nèi)病毒的清除,防止或減輕動物的病理癥狀,并可以較大的提高動物在PRRSV病毒攻擊后的存活率。本項研究是迄今為止對PoI

9、FN-δ在動物體上抗病毒和疫苗佐劑作用的首次探討。本項研究為未來應(yīng)對各種家豬病毒性疾病提供了一個新的可行方向。
　　到目前為止,證明非脊椎動物中存在脊椎動物螺旋細胞因子類似物的證據(jù)主要來源于生理生化水平的功能分析,然而缺乏遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的相關(guān)數(shù)據(jù)。以前的研究表明,利用比較基因組學(xué)的分析方法在果蠅的基因組內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)任何的細胞因子的同源序列。在本項研究中,我們從GenBank數(shù)據(jù)庫中收集到12種魚細胞因子的序列信息,利用Hid

10、den Markov Models構(gòu)建出每種細胞因子的一致性序列:我們進一步利用SMART軟件計算得到每條一致性序列的保守區(qū)域,將這12條保守區(qū)域序列作為模板在果蠅RefSeq蛋白數(shù)據(jù)庫中進行PSI-BLAST、比對分析,最后利用脊椎動物螺旋細胞因子的性質(zhì)對候選序列進行過濾篩選。通過分析,我們在Drosophila melanogaster中得到了一個蛋白序列,CGl4629(NP-569881),它與魚M17在氨基酸序列N端的101個

11、殘基存在25％一致性和46％相似性。進一步分析表明,CGl4629屬于DUFl397蛋白質(zhì)家族,存在DUFl397特異性的保守序列,該家族的蛋白均為血淋巴細胞分泌的糖基化蛋白,并能夠在昆蟲脂肪體(fat body)中合成。根據(jù)以上分析,并考慮到M17與LIF/CNTF的同源性并且Dome受體與LIFR/CNTFR的同源性,我們認為CGl4629是非脊椎動物中LIF/CNTF/M17螺旋細胞因子的類似物,它為尋找非脊椎動物中螺旋細胞因子的